白假絲酵母菌對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用

張琳 車團(tuán)結(jié) 史曉艷 何祥一

（1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)研究室；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)研究所，蘭州 730000）

白假絲酵母菌對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)作用

張琳1車團(tuán)結(jié)2史曉艷1何祥一1

（1.蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)研究室；2.蘭州大學(xué)生命科學(xué)院 細(xì)胞生物學(xué)研究所，蘭州 730000）

目的 研究白假絲酵母菌（S.albicans）對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。方法 體外培養(yǎng)ECV304，實(shí)驗(yàn)分為S.albicans上清液組、S.albicans滅活菌液組、上清液和滅活菌液混合組、對照組。采用MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、倒置顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)分別觀察各組對ECV304細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 在不同濃度、不同時(shí)間的培養(yǎng)條件下，4倍稀釋的S.albicans上清液在培養(yǎng)48 h能顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖；倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)4倍稀釋的S.albicans上清液實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度明顯增高；上清液和滅活菌液分別作用細(xì)胞40h后，上清液組細(xì)胞S期、G2/M期所占百分比顯著升高，增殖指數(shù)（PI）增高，與對照組相比，有顯著性差異（P＜0.05）。而滅活菌液組的PI值無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論S.albicans的代謝產(chǎn)物可引起ECV304細(xì)胞的增殖。

白假絲酵母菌； 增殖； 代謝產(chǎn)物； 細(xì)胞周期

酵母菌為條件致病菌，可寄生于正常人皮膚或口腔黏膜表面。當(dāng)有全身或局部誘發(fā)因素如有營養(yǎng)攝入不足、長期使用廣譜抗生素或免疫抑制劑、長期配戴活動(dòng)義齒等條件時(shí)易誘發(fā)口腔黏膜感染。

自Jepsen等在口腔黏膜白斑的上皮角質(zhì)層中找到酵母菌的菌絲以來[1]，白假絲酵母菌（Saccharomyces albicans,S.albicans）與口腔白斑的關(guān)系引起國內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。口腔白假絲酵母菌性白斑又稱口腔慢性增殖性白假絲酵母菌?。╟hronic hyperplasticSaccharomyces albicans，CHS），是口腔白斑伴有酵母菌慢性感染，屬于角化型癌前病變。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)：在口腔酵母菌菌群中，S.albicans是最常見的病原體，約占67%～80%。流行病學(xué)的調(diào)查[4]顯示：口腔白斑患者中，S.albicans的檢出率為34%，受S.albicans感染過的動(dòng)物可建立白斑動(dòng)物模型。病理觀察[5]發(fā)現(xiàn)：白斑伴有上皮細(xì)胞異常增生時(shí)，其惡變潛能隨上皮細(xì)胞異常增生程度的增加而增大。這些研究表明：侵入上皮的S.albicans不僅并發(fā)感染引起炎性反應(yīng)，還有可能引起上皮增殖形成白斑。S.albicans在口腔白斑發(fā)病過程中的致病機(jī)制尚無定論，目前主要集中在研究S.albicans與上皮關(guān)系的層面上，如Zhu等[6]闡述了S.albicans黏附機(jī)制和入侵黏膜上皮細(xì)胞的分子機(jī)制。本研究采用體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的實(shí)驗(yàn)方法來模擬人口腔黏膜上皮細(xì)胞，利用S.albicans培養(yǎng)上清液及其滅活菌體處理成分與細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其對細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

S.albicansATCC 90028（由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈）。ECV304購自中國科學(xué)院上海藥物研究所；MTT（批號9710）（Sigma公司，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），新生小牛血清（杭州四季青生物公司）。

1.2 方法

1.2.1S.albicans上清液和滅活菌液的制備 將S. albicans在37℃沙堡氏液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)48 h后，并高速離心（4 000 r·min-1、30min）。上清液用0.22μm濾膜2次過濾除菌后得到S.albicans上清液；10%甲醛溶液固定菌沉淀5 d，磷酸緩沖液洗2次后稀釋沉淀物至每毫升5×106CFU，即得S.albicans滅活菌液，備用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 1）S.albicans上清液組：作用時(shí)間恒定（40h）、不同作用濃度（RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋S.albicans上清液為3個(gè)實(shí)驗(yàn)終濃度1×、4×、16×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時(shí)間（24、48、72 h）。2）S.albicans滅活菌液組：作用時(shí)間恒定（40 h）、不同作用濃度（RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋S.albicans滅活菌液為3個(gè)實(shí)驗(yàn)終濃度1×、4×、16×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時(shí)間（24、48、72 h）。3）上清液和滅活菌混合組，即將4×稀釋的上清和滅活菌分別按1∶2、2∶1進(jìn)行混合：作用時(shí)間恒定（40 h）、不同作用濃度（RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋上清液加滅活菌混合液為3個(gè)實(shí)驗(yàn)終濃度4×、16×、64×）；作用濃度恒定（4×）、不同作用時(shí)間（24、48、72 h）。4）對照組：加入等量完全培養(yǎng)基。

1.2.3 ECV304細(xì)胞傳代培養(yǎng) ECV304細(xì)胞來源于健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤游離端臍帶，分離臍靜脈后得到的永生內(nèi)皮細(xì)胞株。早在1984年國外已有學(xué)者應(yīng)用其進(jìn)行感染菌與宿主細(xì)胞交互作用方面的實(shí)驗(yàn)探索[7]。因缺乏正常口腔黏膜細(xì)胞系的來源，而臍帶內(nèi)皮細(xì)胞具有與口腔黏膜細(xì)胞最為接近的生理特性，故本實(shí)驗(yàn)用ECV304模擬人口腔黏膜上皮細(xì)胞。

復(fù)蘇凍存的ECV304細(xì)胞，在含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、95%空氣及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長滿瓶壁的80%以上時(shí)傳代。收獲指數(shù)生長期的ECV304細(xì)胞，備用。

1.2.4 MTT法測定ECV304細(xì)胞增殖率 用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×105個(gè)，接種于96孔板，每孔100mL，設(shè)3個(gè)平行。24 h細(xì)胞完全貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期后，將上清液、滅活菌液（1×、4×、16×）；上清加滅活菌液（2∶1）、上清加滅活菌液（1∶2）（4×、16×、64×），每孔10μL分別加入細(xì)胞中。37℃培養(yǎng)40 h后，每孔加入MTT（5mg·mL-1）10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去孔內(nèi)液體，加入10%SDS液每孔120μL，置于培養(yǎng)箱中12 h后，EL340酶聯(lián)免疫儀在490 nm單波長下測定每孔的吸光度A值。每組設(shè)5孔平行。細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度A值-對照組吸光度A值）/對照組吸光度A值×100%。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定ECV304細(xì)胞增殖變化 用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升5×104個(gè)接種于6孔板，每孔2mL。24 h細(xì)胞完全貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期后加入4×上清液、4×滅活菌懸液、16×上清加滅活菌液（2∶1）、16×上清加滅活菌液（1∶2），每孔200μL。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h后取出，胰酶消化后細(xì)胞計(jì)數(shù)，每組設(shè)3孔平行。

1.2.6 光鏡密度觀察ECV304細(xì)胞 ECV304細(xì)胞以每毫升5×104個(gè)密度接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h后分別加入4×上清液、4×滅活菌懸液，40 h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度變化。

1.2.7S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細(xì)胞周期的影響 將ECV304細(xì)胞置于10mL完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁進(jìn)入對數(shù)生長期后，加入1mL的4×上清液、4×滅活菌懸液、另設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的細(xì)胞為對照。繼續(xù)培養(yǎng)40 h后，2.5 g·L-1胰酶消化細(xì)胞，收集于離心管中，PBS洗2次，加入碘化丙啶染液，避光4℃作用30min，流式細(xì)胞儀收集檢測細(xì)胞DNA周期。軟件分析G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行。增殖指數(shù)（proliferation index，PI）（%）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G1/M）×100%。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行分析，分別對各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S.albicans上清液與滅活菌液對ECV304細(xì)胞增殖作用的影響

不同濃度的S.albicans上清液與滅活菌液對ECV 304細(xì)胞增殖作用的影響見表1，由表1可見，不同稀釋濃度的上清液，當(dāng)作用時(shí)間為40 h時(shí)均可促細(xì)胞增殖，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）；不同稀釋濃度的滅活菌液對細(xì)胞增殖的作用，在4×滅活菌液時(shí)，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。但在原倍（1×）和高倍（16×）稀釋時(shí)，經(jīng)檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 上清液和滅活菌液作用40 h后對ECV304細(xì)胞增殖的影響Tab 1 The effect of S.albicans supermatant and inactivated bacilli on cell proliferation of ECV304 after 40 h

2.2 S.albicans上清液加滅活菌混合液對ECV304細(xì)胞增殖作用的影響

不同濃度的S.albicans上清液加滅活菌混合液對ECV304細(xì)胞增殖作用的影響見表2，由表2可見，上清液和滅活菌的混合液作用細(xì)胞40 h后，隨著稀釋倍數(shù)的增大，促細(xì)胞增殖率逐漸降低。當(dāng)上清液加滅活菌液（2∶1）作用細(xì)胞時(shí)，在較低稀釋倍數(shù)（4×、16×）時(shí)，明顯促細(xì)胞增殖，與對照組相比差異有顯著性（P＜0.05）。但當(dāng)稀釋倍數(shù)增大到64×?xí)r、上清液加滅活菌液（1∶2）的混合液作用后無明顯變化（P＞0.05）。

表2 上清液和滅活菌混合液作用40 h后對ECV304細(xì)胞增殖的影響Tab 2 The effect of S.albicans supermatant and inactivated bacillim ixture on cell proliferation of ECV304 after 40 h

2.3 S.albicans不同組分在不同培養(yǎng)時(shí)間下對ECV304細(xì)胞增殖作用的影響

S.albicans不同組分在不同培養(yǎng)時(shí)間下對ECV304細(xì)胞增殖作用的影響見圖1。

圖1 各組對ECV304細(xì)胞生長影響的曲線圖Fig 1 The influence of each component on the growth of ECV304

由圖1可見，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定一定濃度的S. albicans不同組分分別作用ECV304細(xì)胞24、48、72h，隨著時(shí)間增長，4×上清液和4×滅活菌液在不同時(shí)間較正常對照組均有不同程度的增殖。其中4×上清液在作用24、48 h時(shí)，與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）。但72h時(shí)，與正常相比無明顯變化（P＞0.05）；4×滅活菌液在作用48 h時(shí)對細(xì)胞有顯著促進(jìn)增殖的作用（P＜0.05），而在24 h和72 h則無明顯變化（P＞0.05）。與對照組相比，16×上清和滅活菌的混合液在各個(gè)作用時(shí)間均對細(xì)胞無明顯促進(jìn)增殖的作用（P＞0.05）。

2.4 S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細(xì)胞密度變化的影響

ECV304細(xì)胞經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組處理40 h后（圖2），4倍稀釋的滅活菌液組（圖2C）與對照組（圖2A）細(xì)胞密度相當(dāng)，4倍稀釋的S.albicans上清液組（圖2B）細(xì)胞密度明顯高于4倍稀釋的滅活菌液組與對照組。

2.5 S.albicans上清液和滅活菌液對ECV304細(xì)胞周期的影響

S.albicans的上清液和滅活菌液在作用ECV304細(xì)胞40 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期時(shí)相結(jié)果見表3。與對照組相比，上清液組G0/G1組細(xì)胞所占比例降低，S期、G2/M期所占百分比顯著升高，反映細(xì)胞增殖活力指數(shù)PI增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測S期和G2/M期與對照組間差異有顯著性（P＜0.05）。而滅活菌組的細(xì)胞PI值與對照組相比無明顯變化（P＞0.05）。

圖2 不同組作用40 h后ECV304細(xì)胞密度變化 倒置顯微鏡 ×100Fig 2 The changes in cell density of ECV304 for 40 hours by different groups inverted microscope ×100

表3 上清液和滅活菌液對ECV304細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Tab 3 The effect of S.albicans supernatant and inactivated bacteria on cell cycle distribution of ECV304

3 討論

許多研究從體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面闡述了S.albicans有很大的致病潛力，但S.albicans致病機(jī)制尚無定論[8]。在人和動(dòng)物假絲酵母菌病中，盡管菌絲成分未侵入角質(zhì)層以下，但在上皮內(nèi)和上皮下的組織都發(fā)生了明顯的改變[9]。病變區(qū)上皮較其他白斑厚，上皮深層增生顯著，有絲分裂增加，常出現(xiàn)錯(cuò)角化。張凌等[10]采用流式細(xì)胞儀觀察白假絲酵母菌對口腔上皮細(xì)胞的增殖及細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)菌絲型白假絲酵母菌可改變口腔上皮細(xì)胞周期。促增殖的因素可以是菌體本身，也可能是活菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所致。但對此方面深入的研究，國內(nèi)尚無報(bào)道。本研究提取S.albicans上清液和滅活菌液分別作用細(xì)胞，采用MTT法進(jìn)行橫向比對（固定時(shí)間，不同作用濃度），細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行縱向比對（固定濃度、不同作用時(shí)間），以及細(xì)胞密度觀察，流式細(xì)胞術(shù)研究S. albicans代謝產(chǎn)物和菌體自身對細(xì)胞增殖作用的影響，以解析S.albicans的致病性。

研究結(jié)果顯示：在固定時(shí)間，不同作用濃度的實(shí)驗(yàn)條件下，較高濃度上清液和滅活菌液可促使細(xì)胞增殖，上清液是主要因素。在固定濃度、不同作用時(shí)間的實(shí)驗(yàn)條件下，在實(shí)驗(yàn)早期（0～48 h），不同組分對細(xì)胞促增殖影響基本呈正相關(guān)，以上清液促增殖最為明顯，在作用時(shí)間為48 h時(shí)，促細(xì)胞增長達(dá)到最大。一定濃度滅活菌液在作用48 h時(shí)，與對照相比，也有促增殖影響。延長培養(yǎng)時(shí)間至72 h，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組和對照組均已無顯著差異。可能的原因是隨著時(shí)間的增長，上清液和滅活菌液促細(xì)胞增殖的活性物質(zhì)發(fā)生了降解。也可能由于培養(yǎng)時(shí)間過長，細(xì)胞在6孔板有限的競爭空間不足有關(guān)。

倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：ECV304細(xì)胞經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)組處理40 h后，上清液作用的細(xì)胞密度顯著高于正常組和滅活菌液組，說明上清液對細(xì)胞增殖產(chǎn)生了影響。

細(xì)胞周期中G1期是DNA合成前期，主要包括RNA和DNA聚合酶的合成。S期是DNA合成期，G2/M期是DNA合成后期，主要進(jìn)行RNA及蛋白質(zhì)的合成。增殖旺盛的細(xì)胞處于S期和G2/M期比例較高。本研究結(jié)果顯示：上清液組G0/G1期細(xì)胞所占比例降低，S期、G2/M期所占百分比顯著升高，反映細(xì)胞增殖活力指數(shù)PI增高（P<0.05）。而滅活菌液組的細(xì)胞PI值與對照組相比無明顯變化。說明當(dāng)上清液、滅活菌液分別作用細(xì)胞時(shí)，上清液仍是主要促細(xì)胞增殖因素。

高巖等[11]對假絲酵母菌性白斑的研究表明：假絲酵母菌白斑的上皮較其他白斑的上皮厚，有絲分裂增多，DNA合成較多，細(xì)胞周期時(shí)間縮短；上皮層次紊亂，部分基底細(xì)胞極性消失，核大而濃染，細(xì)胞呈現(xiàn)多形性。提示白假絲酵母菌的慢性感染可導(dǎo)致細(xì)胞分裂活動(dòng)增加，最終引起黏膜增生。這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌上清液可誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞增殖的結(jié)果相符合。

S.albicans黏附并成功定植在宿主黏膜表面是其致病的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。近年來，關(guān)于S. albicans黏附、入侵黏膜內(nèi)皮進(jìn)而感染機(jī)體的機(jī)制性研究也開展了許多。Dalle等[12]研究發(fā)現(xiàn)：S.albicans入侵上皮細(xì)胞并感染機(jī)體不僅取決于S.albicans的形態(tài)和活力，也在于上皮細(xì)胞的形態(tài)和對微生物的敏感性。本實(shí)驗(yàn)的研究表明：白假絲酵母菌的代謝產(chǎn)物對內(nèi)皮細(xì)胞增殖有誘導(dǎo)作用，但其機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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（本文編輯 湯亞玲）

A study on hum an umbilical vein endothelial cell ECV304 proliferation induced by Saccharomyces albicans

ZHANG Lin1,CHE Tuan-jie2,SHI Xiao-yan1,HE Xiang-yi1.（1.Dept.of Prosthodontics,School of Stomatology,Lanzhou University,Lanzhou730000,China;2.Cell Biology Institute,School of Life Science,Lanzhou University,Lanzhou730000,China）

ObjectiveTo study the effects ofSaccharomyces albicans（S.albicans）on the cell cycle distribution and proliferation of human umbilical vein endothelial cell ECV304 cellsin vitro.MethodsThe line of ECV304 culturedin vitrowere divided into four groups which were treated byS.albicanssupernatant,S.albicansinactivated bacilli,supernatant and inactivated bacillimixture,normal culture medium.The proliferous effect of ECV304 induced by supernatant, inactivated bacilli,supernatant and inactivated bacilli mixture using the methods of MTT,cell count,microscope and flow cytometry were conducted.Results In the condition of different times and different culture concentrations,ECV304 cells incubated with 4-fold dilutedS.albicanssupernatant for 48h increased the proliferation rate.The S and G2/M population of ECV304 cells increased after incubated withS.albicanssupernatant for 40h,which showed significant increasing cell proliferation index（PI）（P＜0.05）.The PI of the cells treated by inactivated bacilli showed no significant change（P＞0.05）.ConclusionS.albicanscould induce ECV304 cell proliferation which depends on the release of metabolic products ofS.albicans.

Saccharomyces albicans； proliferation； metabolic product； cell cycle

R 781.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.018

1000－1182（2011）03－0289-05

2010-06-19；

2010-12-21

甘肅省科技攻關(guān)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（0709TCYA053）

張琳（1983—），女，陜西人，碩士

何祥一，Tel：13038730686