磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶信號(hào)通路與正畸牙移動(dòng)的關(guān)系

劉奕 王巖 孫素芬

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 奉天門(mén)診，沈陽(yáng) 110013）

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶信號(hào)通路與正畸牙移動(dòng)的關(guān)系

劉奕 王巖 孫素芬

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 奉天門(mén)診，沈陽(yáng) 110013）

目的 探討磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶（AKt）信號(hào)通路與正畸牙移動(dòng)的關(guān)系。方法 選用24只日本大耳白兔建立正畸牙移動(dòng)的動(dòng)物模型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上頜右側(cè)戴矯治器，作為實(shí)驗(yàn)側(cè)；上頜左側(cè)未戴矯治器，作為對(duì)照側(cè)。分別在戴矯治器3、5、7、14 d后各處死6只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）及Western blot免疫印跡分析方法對(duì)PI3K、AKt表達(dá)的變化進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 RQ-PCR結(jié)果顯示：加力3 d后，牙周組織中PI3K、AKtmRNA表達(dá)增強(qiáng)；7 d后牙周組織中PI3K、AKtmRNA明顯增強(qiáng)，隨后緩慢下降，與對(duì)照側(cè)相比，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western blot免疫印跡分析與RQ-PCR結(jié)果一致。結(jié)論 正畸力作用下兔牙周組織中PI3K、AKt的表達(dá)增加。提示PI3K/AKt信號(hào)通路與正畸牙移動(dòng)有關(guān)，PI3K/AKt信號(hào)通路參與正畸牙移動(dòng)過(guò)程中的牙周組織改建。

磷脂酰肌醇-3-激酶； 蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶； 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）/蛋白質(zhì)絲氨酸-蘇氨酸激酶（proteinserine-threonine kinase，AKt）信號(hào)通路激活主要促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移以及血管生成[1-2]。目前在腫瘤領(lǐng)域研究較多，但PI3K/AKt信號(hào)通路與正畸牙移動(dòng)及牙周組織改建關(guān)系的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)建立動(dòng)物模型，觀察PI3K、AKt在牙周組織中的表達(dá)變化，探討PI3K/AKt信號(hào)通路在正畸牙移動(dòng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物模型的建立

選取由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的日本大耳白兔24只，體重為（2.0±0.2）kg，雌雄不限。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均定時(shí)、定量攝食，自由飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上頜右側(cè)戴矯治器進(jìn)行加力，作為實(shí)驗(yàn)側(cè)；上頜左側(cè)未戴矯治器，作為對(duì)照側(cè)。喂養(yǎng)1周后，2%戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉（2mL·kg-1），使用牙科細(xì)金剛砂車針在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右側(cè)上頜第一磨牙和左、右側(cè)上頜切牙牙頸部磨溝，深約0.5mm，然后將左、右上頜切牙連扎，并在其與右側(cè)上頜第一磨牙間放置鎳鈦螺簧，以左、右側(cè)上頜切牙為支抗，牽引右側(cè)上頜第一磨牙向近中移動(dòng)，力值為0.784N。在戴矯治器3、5、7、14 d后，經(jīng)耳緣靜脈注入空氣，肺栓塞處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每次6只。取牙周組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 總RNA的提取及質(zhì)量控制

依據(jù)RNA提取液和試劑盒說(shuō)明提取凍結(jié)組織總RNA，去除骨膠原等雜質(zhì)，在260 nm和280 nm波長(zhǎng)紫外光下測(cè)定光密度值（A值），計(jì)算A260nm/A280nm值，測(cè)得純度為1.8±0.3。逆轉(zhuǎn)錄按實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)

PI3K引物序列：上游5’-GCCCAGGCTTACTACAGAC-3’；下游5’-AAGTAGGGAGGCATCTCG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為236bp。AKt引物序列：上游5’-CTCATTCCAGACCCACGAC-3’；下游5’-ACAGCCCGAAGTCCGTTA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為242 bp。β-actin為參照，引物序列：上游5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’；下游5’-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為318 bp。

1.4 RQ-PCR產(chǎn)物檢測(cè)

采用熒光染料（SYBR Green）標(biāo)記的RQ-PCR法檢測(cè)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）mRNA的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作，選用olign（dT）作引物合成第一鏈cDNA，RQ-PCR檢測(cè)正畸力作用下PI3K和AKt在牙周組織中的表達(dá)變化。所有的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在ABI Prism 7500HT序列檢測(cè)系統(tǒng)中運(yùn)行。3次獨(dú)立樣本經(jīng)過(guò)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)用公式RQ=2-△△Ct進(jìn)行分析。

1.5 Western blot免疫印跡

將組織塊剪碎，懸于500μL冰冷緩沖液A（含有20mmol·L-1Triso-HCl、pH值為7.5的0.1 mmol·L-1Na3VO4、25mmol·L-1NaF、2mmol·L-1乙二胺四乙酸、2mmol·L-1乙二醇二乙醚二胺四乙酸、1mmol·L-1DDT、1mmol·L-1苯甲基磺酰氟、2μg·mL-1胰蛋白酶抑制劑、1mmol·L-1亮抑蛋白酶肽）中，冰浴中將組織勻漿粉碎，4℃下18 000 r·min-1離心30min，吸取上清，棄沉淀，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白濃度。上清用10%SDS-PAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，經(jīng)2h 50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜3次，每次5min。用含5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的TTBS封閉，4℃過(guò)夜，再與抗PI3K、AKt抗體室溫孵育2 h，與相應(yīng)的HRp標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，超敏化學(xué)發(fā)光試劑系統(tǒng)顯影。采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，配對(duì)t檢驗(yàn)分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RQ-PCR結(jié)果

正畸施力3 d后，PI3K、AKtmRNA表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng)，7 d出現(xiàn)高峰，14 d呈下降趨勢(shì)（圖1、2）。其中7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)PI3KmRNA灰度值比為4.04∶1，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)AKtmRNA灰度值比為4.35∶1，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)PI3K、AKt相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在3、5、7、14 d，實(shí)驗(yàn)側(cè)與對(duì)照側(cè)PI3K、AKt相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 RQ-PCR檢測(cè)PI3KmRNA在牙周組織中的表達(dá)Fig 1 Expression of the PI3K mRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

圖2 RQ-PCR檢測(cè)AKtmRNA在牙周組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of the AKtmRNA in the periodontal tissue by RQ-PCR

2.2 Western blot免疫印跡結(jié)果

施力牙周組織中PI3K、AKt蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照側(cè)，尤其第7天時(shí)，隨后又呈下降趨勢(shì)（圖3、4）。經(jīng)灰度值分析（圖5、6）：施力7 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)PI3K、AKt的表達(dá)量分別為對(duì)照側(cè)的3.51、5.42倍。3、5、7、 14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)側(cè)PI3K、AKt與對(duì)照側(cè)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中第7天差異顯著（P<0.01）。

圖3 PI3K的Western blot免疫印跡結(jié)果Fig 3 Results of Western blot analysis of PI3K

圖4 AKt的Western blot免疫印跡結(jié)果Fig 4 Results of Western blot analysis of AKt

圖5 PI3K的Western blot免疫印跡結(jié)果的灰度值分析Fig 5 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of PI3K

圖6 AKt的Western blot免疫印跡結(jié)果的灰度值分析Fig 6 Grey scale analysis of Western blot determined the expression of AKt

3 討論

牙頜畸形的矯治必須對(duì)錯(cuò)位的牙、牙弓或頜骨施加一定的矯治力，以引起牙周組織、頜骨在生理限度內(nèi)的組織改建，這樣才能使牙移動(dòng)，恢復(fù)或重建咬合平衡，從而使牙頜系統(tǒng)獲得理想的外形，發(fā)揮正常的功能，達(dá)到矯治畸形的目的[3]。骨的生長(zhǎng)與代謝直接或間接的影響正畸療效，因此，必須深入研究正畸力作用下牙移動(dòng)的分子機(jī)制，尋求更有效的方法，縮短療程，減輕患者的負(fù)擔(dān)。

mTOR作為一種重要的調(diào)節(jié)基因，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞能量代謝等多種途徑發(fā)揮重要的生理功能，在細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用[4-6]。筆者圍繞mTOR的上下游做了大量工作。在前期研究中，檢測(cè)到正畸牙移動(dòng)時(shí)，在兔牙周組織中mTOR及其下游底物p70 S6K的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示mTOR和p70 S6K參與牙周組織改建，并在牙周組織改建中起作用[7-8]。

mTOR通過(guò)PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。AKt可直接磷酸化mTOR的Ser2448位點(diǎn)，激活mTOR和它的下游途徑，控制著細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化所需特殊蛋白質(zhì)的翻譯。PI3K/AKt信號(hào)途徑現(xiàn)被認(rèn)為是真核細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的關(guān)鍵信號(hào)途徑[9]。PI3K/ AKt/mTOR信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞即間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于骨骼系統(tǒng)中，在一定的條件下可以通過(guò)核心結(jié)合因子基因的激活誘導(dǎo)成骨分化。應(yīng)用雷帕霉素阻斷該通路在成骨細(xì)胞中的活化，觀察到成骨細(xì)胞的分化明顯受到了抑制。表現(xiàn)在鈣質(zhì)沉積的茜西紅染色減弱，顯示成骨細(xì)胞分化能力明顯下降[10]。表明PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路的活化在成骨前體細(xì)胞的分化過(guò)程中起作用。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了mTOR的一條主要上游通路PI3K/ AKt的表達(dá)。結(jié)果表明PI3K、AKt在正畸施力3 d后表達(dá)增強(qiáng)，7 d達(dá)高峰，而14 d后有下降趨勢(shì)，推測(cè)：正畸力激活成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞自身產(chǎn)生激肽和生長(zhǎng)因子，正反饋激活自身活化，通過(guò)生長(zhǎng)因子調(diào)控PI3K/ AKt/mTOR信號(hào)通路，最終影響成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞蛋白的合成、轉(zhuǎn)錄過(guò)程，產(chǎn)生一系列的生物效應(yīng)，最終引發(fā)正畸牙齒移動(dòng)。正畸牙移動(dòng)依賴于牙槽骨的改建，這一改建過(guò)程存在一個(gè)多因素的調(diào)控體系。PI3K、AKt在矯治力作用下的牙周組織改建過(guò)程中表達(dá)明顯增強(qiáng)，證明PI3K、AKt參與正畸牙齒移動(dòng)過(guò)程中的牙周組織改建。改建過(guò)程需要合成更多的蛋白，PI3K、AKt的表達(dá)增強(qiáng)就是為大量合成蛋白質(zhì)打基礎(chǔ)。關(guān)于PI3K/AKt信號(hào)通路與正畸力作用下牙周組織改建關(guān)系的研究，將會(huì)進(jìn)一步提示正畸力作用下牙周組織改建的發(fā)生機(jī)制，并為臨床加速正畸牙移動(dòng)提供有效的理論依據(jù)。

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（本文編輯 胡興戎）

The relationship between phosphatidylinositol-3-kinases/protein-serine-threonine kinase signaling pathway and orthodontic tooth movement

LIU Yi,WANG Yan,SUN Su-fen.（Fengtian Dental Clinic,School of Stomatology,China Medical University,Shenyang110013，China）

ObjectiveTo study the relationship between phosphatidylinositol-3-kinases（PI3K）/protein-serine-threonine kinase（AKt）signaling pathway and orthodontic tooth movement.MethodsTwenty-four rabbits were chosen to establish rabbit models for the study.The right maxillary teeth of each animal treated by orthodontics were as the test side, and the untreated left teeth were as the control side.The animals were sacrificed at 3,5,7,14 d,respectively.The prepared tissue specimens were processed for the study.The changes of the expression of PI3K,AKt in periodontal tissues were detected by real-time quantitative-polymerase chain reaction（RQ-PCR）and Western blot techniques.Results RQ-PCR showed that the expression of PI3K,AKtmRNA dramatically changed at 3 d.The expression of PI3K,AKt mRNA in the test side was higher than the control side,especially at 7 d,and then decreased.Compared with the control side,there was statistical significant difference in the test side（P＜0.05）.The study obtained consistent conclusion from Western blot and RQ-PCR.ConclusionExpression of PI3K,AKt in rabbit periodontal tissues increase during orthodontic tooth movement,which prompts that PI3K/AKt signal pathways relate to orthodontic tooth movement and PI3K/AKt signal pathway involve in the periodontal tissue remodeling.

phosphatidylinositol-3-kinases； protein-serine-threonine kinase； real-time quantitative-polymerase chain reaction

R 783.5

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.006

1000－1182（2011）03－0246-03

2010-05-21；

2011-04-05

遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（2009225010-27）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃基金資助項(xiàng)目（1072033-1-00）

劉奕（1964—），女，遼寧人，教授，博士

劉奕，Tel：024-31973999