三維培養(yǎng)模型中胰島素樣生長因子-Ⅰ對人牙周膜細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響

李彥 牛忠英 湯楚華 包博 師天鵬 司少艷

（1.解放軍總醫(yī)院 軍醫(yī)進修學(xué)院，北京 100853；

2.解放軍第306醫(yī)院 全軍口腔疾病診治中心；3.病理實驗科，北京 100101）

三維培養(yǎng)模型中胰島素樣生長因子-Ⅰ對人牙周膜細胞增殖及堿性磷酸酶活性的影響

李彥1，2牛忠英2湯楚華2包博2師天鵬2司少艷3

（1.解放軍總醫(yī)院 軍醫(yī)進修學(xué)院，北京 100853；

2.解放軍第306醫(yī)院 全軍口腔疾病診治中心；3.病理實驗科，北京 100101）

目的 了解胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）在三維培養(yǎng)條件下對人牙周膜細胞（hPDLCs）增殖及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。方法 通過組織塊法分離培養(yǎng)hPDLCs。采用旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)（RCCS）建立三維培養(yǎng)環(huán)境。將細胞分為4組，分別為陰性對照組、陽性對照組（三維培養(yǎng)組、IGF-Ⅰ組）、實驗組（三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組）。各組細胞分別培養(yǎng)1、3、5、7 d。采用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測各組各時間點細胞增殖情況，分光光度計法檢測ALP活性。結(jié)果 與陰性對照組相比，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組細胞增殖自3 d時顯著增加（P<0.05），且高于三維培養(yǎng)組（P<0.05）。在培養(yǎng)3、5、7 d時，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組ALP活性顯著高于陰性對照組（P<0.05）；與三維培養(yǎng)組相比，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組ALP活性在3、5、7 d均顯著增高（P<0.05）。結(jié)論 IGF-Ⅰ在三維培養(yǎng)條件下仍可顯著促進hPDLCs增殖及其ALP活性。

人牙周膜細胞； 胰島素樣生長因子-Ⅰ； 增殖； 堿性磷酸酶； 三維培養(yǎng)

牙周炎是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因，缺損牙周組織的修復(fù)催生了牙周組織工程的發(fā)展。而體外構(gòu)建具有生理結(jié)構(gòu)和功能的牙周組織需建立能夠使細胞三維生長的培養(yǎng)環(huán)境，細胞三維培養(yǎng)體系應(yīng)運而生。已有學(xué)者成功利用三維培養(yǎng)體系構(gòu)建了與體內(nèi)組織形態(tài)及功能相似的軟骨組織塊，并在唾液腺上皮細胞、成骨細胞、肝細胞、心肌細胞等多種細胞的三維培養(yǎng)上取得了進展[1-2]。筆者在前期研究中也成功地建立了人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）的三維培養(yǎng)模型，并觀察到三維培養(yǎng)環(huán)境可促進細胞增殖及成骨向分化[3]。

胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ）是一種重要的調(diào)控因子。研究表明：IGF-Ⅰ在牙周膜細胞外基質(zhì)及血管周圍有表達，并可通過自分泌及旁分泌等方式作用于靶細胞，是調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的關(guān)鍵因子。本研究中分離培養(yǎng)了hPDLCs，通過比較各組細胞增殖及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，探討IGF-Ⅰ在三維培養(yǎng)環(huán)境中對hPDLCs增殖及成骨向分化的調(diào)控作用，并且為進一步研究體外構(gòu)建牙周組織提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

雙抗PBS液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、0.25%胰蛋白酶、抗壞血酸、甲基噻唑基四唑（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）試劑（Gibco公司，美國），IGF-Ⅰ、ALP檢測試劑盒、Triton X-100、考馬斯亮蘭（Sigma公司，美國），二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、青霉素、鏈霉素（Amresco公司，美國），抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體（Dako公司，美國），流式細胞分析儀（Coulter公司，美國），紫外線分光光度儀（Eppendorf公司，德國），55mL旋轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)體系（rotary cell culture system，RCCS）（Synthecon公司，美國），軟骨細胞微載體（Cytodex-3，GE Healthcare公司，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)和鑒定 經(jīng)受試者知情同意后，收集因正畸拔除、牙周組織健康、無齲的新鮮前磨牙或第三磨牙共8顆，經(jīng)雙抗PBS液及DMEM液反復(fù)清洗后刮取根中1/3牙周膜組織，剪成1mm3的小塊，以5mm間隔將所得組織塊均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，向內(nèi)加入4mL DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100μmol·L-1抗壞血酸、2mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素）。在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下孵育2 h，使組織塊貼壁，再翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，3 d后更換培養(yǎng)液，2～3 d換液1次，細胞匯合至培養(yǎng)瓶80%時用胰酶消化傳代，取生長良好的第1代細胞制備細胞爬片，用免疫組化SP法進行波形絲蛋白和角蛋白染色，檢測細胞來源并于光鏡下觀察。

1.2.2 實驗分組 為研究IGF-Ⅰ在三維培養(yǎng)環(huán)境中對hPDLCs增殖及ALP活性的影響，將細胞分為4組，分別為陰性對照組（即常規(guī)平皿培養(yǎng)）、陽性對照組（三維培養(yǎng)組和IGF-Ⅰ組）和實驗組（三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組）。預(yù)實驗在三維模型中培養(yǎng)hPDLCs 72 h，經(jīng)MTT法檢測加入不同濃度IGF-Ⅰ（0.1、1、10、100μg·L-1）的各實驗組細胞增殖活性與對照組（三維培養(yǎng)但無IGF-Ⅰ加入）的差異。分光光度計法檢測各組ALP活性。結(jié)果顯示各實驗組增殖活性均顯著高于對照組（P<0.05），0.1μg·L-1組與100μg·L-1組間細胞增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.741，P<0.05）。各實驗組的ALP活性均顯著高于對照組（P<0.05），100μg·L-1組的ALP活性顯著高于其他濃度組（F= 194.362，P<0.05）。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果選擇IGF-Ⅰ實驗濃度為100μg·L-1。

1.2.3 hPDLCs的三維培養(yǎng) 在生物反應(yīng)器中加入150 mg Cytodex-3及含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵育2 h。將hPDLCs單細胞懸液緩慢均勻加入生物反應(yīng)器中并補充新鮮DMEM培養(yǎng)基至半量容積。反應(yīng)器重新放入37℃孵箱中孵育。12 h后從孵箱中取出反應(yīng)器，補充預(yù)熱的含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基，排凈氣泡，調(diào)整反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)速度使微載體懸浮于培養(yǎng)液中，再將其放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖 上述各組分別于培養(yǎng)1、3、5、7 d后，將細胞置于六孔板中，加2mL培養(yǎng)基及MTT液（5 g·L-1）20μL混勻，細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 0.2mL，室溫下放置并振蕩20min，充分溶解結(jié)晶物并混勻。酶標儀在波長490 nm下測定各孔光密度值（A值）。將每組A值的均值作為實驗結(jié)果，代表細胞增殖情況。

1.2.5 分光光度計法檢測ALP活性 檢測時間點同MTT實驗，方法如下：用0.01mol·L-1的PBS洗滌細胞3次，吸干，每孔加入50μL 0.2%的TritonX-100裂解液，37℃裂解30min，倒置顯微鏡下觀察到細胞形態(tài)完全消失后，使用ALP檢測試劑盒檢測各組細胞的ALP活性。采用國際臨床化學(xué)和實驗室醫(yī)學(xué)聯(lián)盟（IFCC）推薦法測定hPDLCs的ALP活性，考馬斯亮蘭微板法定量測定樣本中蛋白量，計算每毫克凍融蛋白中所含的ALP比活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料應(yīng)用2組獨立樣本t檢驗比較均數(shù)差異，單因素方差分析（ANOVA）法分析組間是否存在差別，存在組間差別時采用Tukey法進行組間兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞來源鑒定結(jié)果

培養(yǎng)細胞的鑒定結(jié)果為波形絲蛋白染色陽性（圖1），角蛋白染色陰性（圖2），證實為hPDLCs。

圖1 波形絲蛋白染色陽性 SP ×100Fig 1 Staining of crinkle fibroin was positive SP ×100

圖2 角蛋白染色陰性 SP ×100Fig 2 Staining of keratin was negative SP ×100

2.2 不同培養(yǎng)條件對hPDLCs增殖活性的影響

MTT法檢測不同培養(yǎng)條件下hPDLCs增殖活性的結(jié)果見表1。由表1可見，在培養(yǎng)1、3 d時，陰性對照組與三維培養(yǎng)組細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；培養(yǎng)5、7 d時，三維培養(yǎng)組細胞增殖顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。培養(yǎng)3、5、7 d時，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組細胞增殖均顯著高于陰性對照組（P＜0.05）。在培養(yǎng)3、5、7 d時，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組細胞增殖活性較三維培養(yǎng)組顯著增強（P＜0.05）。三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組與IGF-Ⅰ組相比，細胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 不同培養(yǎng)條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs細胞增殖的影響Tab 1 The effect of IGF-Ⅰon hPDLCs proliferation in different culture conditions ±s

表1 不同培養(yǎng)條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs細胞增殖的影響Tab 1 The effect of IGF-Ⅰon hPDLCs proliferation in different culture conditions ±s

注：*為與陰性對照組相比，P＜0.05；a為與三維培養(yǎng)組相比，P＜0.05。

時間/d細胞增殖陰性對照組 三維培養(yǎng)組 IGF-Ⅰ組 三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組1 0.292±0.017 0.314±0.023 0.387±0.032 0.371±0.041 3 0.331±0.051 0.350±0.047 0.490±0.050* 0.507±0.054*a 5 0.376±0.032 0.446±0.019* 0.573±0.061* 0.581±0.056*a 7 0.412±0.030 0.533±0.051* 0.729±0.054* 0.768±0.062*a

2.3 不同培養(yǎng)條件對hPDLCs ALP活性的影響

與陰性對照組相比，三維培養(yǎng)組、IGF-Ⅰ組及三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組ALP活性在培養(yǎng)3、5、7d時均顯著增強（P＜0.05）。與三維培養(yǎng)組相比，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組ALP活性在培養(yǎng)3、5、7 d顯著增強（P＜0.05）（圖3）。

圖3 不同培養(yǎng)條件下IGF-Ⅰ對hPDLCs ALP活性的影響Fig 3 ALP activity of hPDLCs in different culture conditions

3 討論

hPDLCs是牙周膜的主體細胞，具有多種分化潛能[4]，在維持牙周組織代謝更新的動態(tài)平衡中扮演了重要角色。牙周組織工程正是利用hPDLCs的多向分化特性，通過體外培養(yǎng)獲得具有生理結(jié)構(gòu)及功能的牙周組織。

牙周組織工程的關(guān)鍵在于構(gòu)建三維組織形態(tài)以及調(diào)控細胞分化。RCCS可使細胞隨所附著的載體旋轉(zhuǎn)并懸浮于培養(yǎng)液中，形成培養(yǎng)細胞的三維環(huán)境。有研究表明：RCCS建立的三維細胞培養(yǎng)體系有利于細胞聚集成組織樣結(jié)構(gòu)，并可使細胞間橋連增多[5-6]。這一技術(shù)使體外構(gòu)建三維組織結(jié)構(gòu)成為可能，并已在軟骨細胞、成骨細胞、心肌細胞、唾液腺上皮細胞、卵泡瘤細胞以及肝細胞等多種細胞的三維培養(yǎng)中取得進展[7-12]。

生理狀態(tài)下，hPDLCs的各向分化受多種生長因子的共同調(diào)控。在體外三維培養(yǎng)條件下，模擬體內(nèi)環(huán)境加入相應(yīng)生長因子，將有助于誘導(dǎo)hPDLCs的多向分化，從而構(gòu)建具有生理結(jié)構(gòu)及功能的牙周組織。IGFs廣泛存在于機體組織，其中IGF-Ⅰ在hPDLCs外基質(zhì)及血管周圍含量較高，并通過旁分泌等方式作用于周圍細胞[13]。研究表明：IGF-Ⅰ在間充質(zhì)細胞、成骨細胞及軟骨細胞等細胞類型中扮演著重要的調(diào)控增殖、分化的角色[14-15]。研究結(jié)果顯示，IGF-Ⅰ能夠抑制牙周膜成纖維細胞的DNA裂解，并通過調(diào)控抗凋亡及前凋亡分子的表達而呈現(xiàn)出顯著的抗凋亡作用，此外還觀察到IGF-Ⅰ具有促進骨形成、抑制膠原降解以及介導(dǎo)其他生長因子調(diào)控等作用。然而上述研究均是在平皿培養(yǎng)環(huán)境下得出的，在三維培養(yǎng)模型中IGF-Ⅰ對hPDLCs的作用尚未見報道。

本實驗通過建立三維細胞培養(yǎng)模型，比較IGF-Ⅰ在常規(guī)平皿培養(yǎng)與三維培養(yǎng)的不同條件下對hPDLCs增殖及其ALP活性的影響。通過對MTT檢測結(jié)果的分析可知，與單純的三維培養(yǎng)相比，加入100μg·L-1的IGF-Ⅰ可進一步促進細胞增殖。說明IGF-Ⅰ在三維培養(yǎng)條件下仍具有顯著的促增殖作用。IGF-Ⅰ受體由四聚體糖蛋白組成，其中2個α亞基位于細胞外部，2個β亞基為跨膜蛋白。上述結(jié)果提示三維培養(yǎng)造成的懸浮狀態(tài)并未影響IGF-Ⅰ受體與IGF-Ⅰ的結(jié)合。

ALP作為一種膜結(jié)合蛋白，是牙周膜細胞中成骨細胞亞群的標志性蛋白[16]，其活性可以反映牙周組織改建的活躍程度，ALP活性檢測也是評價hPDLCs功能的重要指標。本研究結(jié)果顯示，無論是常規(guī)培養(yǎng)條件還是三維培養(yǎng)條件，加入IGF-Ⅰ后ALP的活性都表現(xiàn)為顯著增強的趨勢，提示IGF-Ⅰ在常規(guī)培養(yǎng)和三維培養(yǎng)條件下均可以促進hPDLCs的成骨向分化。

綜合分析上述實驗結(jié)果可知，三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組在細胞增殖及ALP活性兩方面都顯著高于陰性對照組及陽性對照中的三維培養(yǎng)組，說明IGF-Ⅰ在三維培養(yǎng)下對hPDLCs具有促增殖和提高ALP活性的作用，并且IGF-Ⅰ與三維培養(yǎng)系統(tǒng)具有協(xié)同作用。但三維培養(yǎng)加IGF-Ⅰ組的細胞增殖及ALP活性與陽性對照中的IGF-Ⅰ組并無顯著差異（僅在5 d時ALP活性高于IGF-Ⅰ組），這一結(jié)果提示IGF-Ⅰ與三維培養(yǎng)系統(tǒng)間的協(xié)同作用并非簡單的相加關(guān)系，具體機制尚待深入研究。陽性對照的三維培養(yǎng)組在細胞增殖及ALP活性等方面均顯著高于陰性對照組，這一結(jié)果與之前研究結(jié)果一致，表明三維培養(yǎng)對細胞增殖及成骨向分化具有一定的促進作用。

本研究結(jié)果提示，通過RCCS構(gòu)建的三維培養(yǎng)模型可用于體外培養(yǎng)hPDLCs，且IGF-Ⅰ在此培養(yǎng)體系可顯著促進細胞增殖及成骨向分化。但成功構(gòu)建具有生理結(jié)構(gòu)及功能的牙周組織需多種生長因子的共同調(diào)控，掌握其作用規(guī)律尚待深入研究。

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（本文編輯 胡興戎）

The effect of insulin-like grow th factor-I on the proliferation and alkaline phosphatase activity of human periodontal ligament cells under three-dimensional culture system

LI Yan1，2,NIU Zhong-ying2,TANG Chu-hua2,BAO Bo2,SHI Tian-peng2,SI Shao-yan3.（1.Military Postgraduate Medical College,General Hospital of PLA,Beijing100853,China;2.Oral Disease Treatment Center of PLA,306Hospital of PLA,Beijing100101,China;3.Dept.of Pathology and Laboratory,306Hospital of PLA,Beijing100101,China）

ObjectiveTo investigate the effect of insulin-like growth factor-Ⅰ（IGF-Ⅰ）on the proliferation and alkaline phosphatase（ALP）activity of human periodontal ligament cells（hPDLCs）under three-dimensional（3D）culture system.MethodsThe hPDLCs were cultured from periodontium of human teeth by the outgrowth method.Rotary cell culture system（RCCS）was enrolled to set 3D culture system.Samples were set to four groups:Negative control group,positive control group（3D group,IGF-Ⅰgroup）,and experimental group（3D with IGF-Ⅰgroup）.Proliferation was tested with methylthiazolyl tetrazolium（MTT）,and ALP activity was assayed by spectrophotometer at 1,3,5,7 d respectively.Results Compared with that of negative control group,cell proliferation increased significantly in 3D with IGF-Ⅰgroup since 3 d（P<0.05）.Besides,the cell proliferation of 3D with IGF-Ⅰgroup was significantly higher than that of 3D group（P<0.05）.ALP activity of 3D with IGF-Ⅰgroup was significantly higher than that of negative control group，and 3D group at 3,5,7 d（P<0.05）.ConclusionIGF-Ⅰsignificantly promotes the proliferation and ALP activity of hPDLCs under 3D culture system.

human periodontal ligament cells； insulin-like growth factor-Ⅰ； proliferation； alkaline phosphatase；three-dimensional culture

R 780.2

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2011.03.002

1000－1182（2011）03－0229-04

2010-12-28；

2011-04-05

國家自然科學(xué)基金資助項目（30870598）

李彥（1979—），女，天津人，主治醫(yī)師，碩士

牛忠英，Tel：010-66355041