不同模式低氧耐力訓(xùn)練對(duì)大鼠肝組織HIF-1α、HO-1 m RNA表達(dá)的影響

徐建方，馮連世，路瑛麗，張 漓，王雪冰

低氧訓(xùn)練的有關(guān)研究源于對(duì)高原訓(xùn)練的探索，其基本原理在于利用低氧和訓(xùn)練的雙重刺激，使機(jī)體產(chǎn)生一系列的適應(yīng)性改變，以最大限度地發(fā)揮機(jī)體的運(yùn)動(dòng)潛能[1]。作為介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，低氧誘導(dǎo)因子-1α （HIF-1α）受低氧誘導(dǎo)，在機(jī)體低氧應(yīng)答和低氧訓(xùn)練適應(yīng)性改變的過程中扮演著重要的角色。大量研究表明，涉及血管舒張、血管生成、細(xì)胞凋亡與增殖等方面的多種靶基因受 H IF-1α調(diào)控，如誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（NOS）、血紅素加氧酶（HO）、血管生長因子（VEGF）等[5，7，14]。HO是催化血紅素生成膽綠素、鐵和CO的微粒體酶，HO-1為其亞基，在改善血流、提高機(jī)體應(yīng)急能力和保護(hù)能力的過程中具有重要的作用[8，13]。

眾所周知，為滿足訓(xùn)練需要，在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練過程中，不可避免地存在著血液重新分配問題，本研究擬就高住高練、高住低練、低住高練3種不同低氧訓(xùn)練模式對(duì)大鼠肝組織HIF-1α、HO-1mRNA表達(dá)的影響進(jìn)行研究，探討低氧訓(xùn)練時(shí)內(nèi)臟器官的適應(yīng)性變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

90只6周齡雄性SD大鼠，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，室溫23℃～25℃，濕度40％～60％，自然光照，自由飲食。

1.2 訓(xùn)練方式

90只實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)適應(yīng)性訓(xùn)練篩選出60只，隨機(jī)分為6組，每組10只：1）常氧安靜組；2）低氧安靜組；3）低住低練組；4）高住高練組；5）高住低練組；6）低住高練組。所有訓(xùn)練組采用水平動(dòng)物跑臺(tái)進(jìn)行耐力訓(xùn)練（表1）。

表1 本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)安排一覽表

1.3 實(shí)驗(yàn)取材

安靜組4周末，運(yùn)動(dòng)組最后一次訓(xùn)練恢復(fù)24 h，按0.3 m l/100 g體重劑量腹腔注射10％水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，期間迅速分離出大鼠肝組織在預(yù)冷的生理鹽水中漂洗去血，濾紙吸干水分，放液氮中速凍，待測(cè)。

1.4 指標(biāo)測(cè)試方法

1.4.1 主要試劑及儀器

MyLab通用型 RNA快速提取試劑盒（美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司，中國）；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶：200u/μl，F(xiàn)ermentas（MBI公司，美國）；RNase Inhibitor：40u/μl，F(xiàn)ermentas （MBI，美國）；420×EvaGreen（Biotium，美國）；Takara TP600型梯度 PCR儀（Takara公司，日本）；SLAN雙通道熒光定量PCR儀（宏石醫(yī)療科技有限公司，中國）。

1.4.2 測(cè)試方法

1.肝組織總RNA提?。河肕yLab通用型RNA快速提取試劑盒提取樣品 RNA，最后加入30μl無 RNase的水，溶解 RNA。用DNase I消化樣品 RNA中的DNA （表2）。

表2 DNA消化方法一覽表

2.RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（表3）。

表3 反轉(zhuǎn)錄操作程序一覽表

3.引物設(shè)計(jì)：所有引物設(shè)計(jì)均為先通過互聯(lián)網(wǎng)從genebank查詢到各個(gè)目的mRNA原序列，選擇合適的序列范圍，再用p rimer 5引物設(shè)計(jì)軟件篩選出合適的引物，各引物序列如下：

β-actin：上游引物-GAAGTGTGACGTTGACATCCG，

下游引物GCCTAGAAGCATTTGCGGTG；

HIF-1α：上游引物CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG，

下游引物TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG；

HO-1：上游引物CAGACAGAGTTTCTTCGCCAG，

下游引物AGAGAGAAGGCTACATGAGACAG。

4.定量PCR檢測(cè)：取0.2μl薄壁 PCR管，分別編號(hào)，向各管中加入不含染料2×qPCR TaqMix 12.5μl，10μM各基因正反向引物混合物0.5μl，對(duì)應(yīng)的cDNA各1μl，一管中不加模板用作陰性對(duì)照，各管補(bǔ)加水至25ml，混勻，置于SLAN熒光定量 PCR儀中。95℃5 min預(yù)變性后， 95℃15 s→65℃35 s（熒光檢測(cè)），40個(gè)循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 低氧訓(xùn)練對(duì)肝組織 H IF1-αmRNA表達(dá)的影響

表4顯示，低氧安靜、低住低練、高住高練、高住低練和低住高練組較常氧安靜組，肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)均有非常顯著性的升高（P＜0.01），其中，高住高練和低氧安靜組升高最為明顯，分別達(dá)到866和802倍，高住低練、低住高練、低住低練組分別升高55、151和34倍。

與低住低練組相比，低氧安靜和高住高練組肝組織HIF-1αmRNA表達(dá)有非常顯著性的升高（分別為23.6和25.8倍，P＜0.01）；高住低練、低住高練組肝組織則無明顯變化。

高住高練組肝組織 H IF-1αmRNA表達(dá)較高住低練和低住高練組均有非常顯著升高（分別達(dá)15.7和5.7倍，P＜0.01）。

高住低練組、低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)較低氧安靜組均有非常顯著性降低（下降達(dá)93.8％和76.3％，P＜0.01）。

2.2 低氧訓(xùn)練對(duì)肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)的影響

表5顯示，與常氧安靜對(duì)照組相比，高住低練組肝組織HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；低氧安靜、低住低練、高住高練和低住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)均有非常顯著升高（分別達(dá) 551、322、875和 324倍，P＜ 0.01）。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低練、低住高練組則無明顯變化。

高住高練組肝組織HO-1 m RNA表達(dá)較高住低練組、低住高練組均有顯著升高（分別達(dá) 2.2和2.7倍，P＜ 0.05）。

表4 低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠肝組織HIF-1αm RNA表達(dá)的影響一覽表

表5 低氧訓(xùn)練對(duì)大鼠肝組織HO-1 m RNA表達(dá)的影響一覽表

3 分析與討論

缺氧是對(duì)機(jī)體的異常刺激，機(jī)體通過特定的系統(tǒng)感受缺氧后，會(huì)發(fā)生一系列生理反應(yīng)，如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、VEGF等表達(dá)增多，以維持功能，減少傷害。目前，關(guān)于缺氧感受信號(hào)傳遞的學(xué)說有：血紅素蛋白學(xué)說、NO和CO學(xué)說、NAD（P）H學(xué)說、線粒體學(xué)說和 HIF-1α感受氧學(xué)說等。低氧訓(xùn)練作為運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練實(shí)踐中的輔助手段，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生環(huán)境低氧和運(yùn)動(dòng)缺氧的雙重刺激，進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體的適應(yīng)性改變[15]。

3.1 低氧訓(xùn)練對(duì)肝組織 H IF-lαmRNA表達(dá)的影響

HIF-1作為一種轉(zhuǎn)錄因子，低氧時(shí)廣泛分布于心、肝、腎、肺、腦、肌肉等許多組織細(xì)胞，是低氧反應(yīng)基因（HRG）表達(dá)的生理性調(diào)控因子，可以被多種胞外刺激活化、上調(diào)，介導(dǎo)低氧反應(yīng)，影響細(xì)胞存活、生長、分化以及凋亡等基因的表達(dá)。研究證實(shí)，H IF-1是調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)平衡的主要調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體生理和病理過程中發(fā)揮重要作用。目前，發(fā)現(xiàn)40多個(gè)基因受其調(diào)控，涉及到血管生成、血管舒張、能量代謝、葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等[2，4]。

已有研究表明，H IF-1α在低氧訓(xùn)練的適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，參與VEGF、iNOS、HO-1等mRNA表達(dá)的調(diào)控。Hoppeler發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)訓(xùn)練的健康人在海拔3 850 m低氧環(huán)境下進(jìn)行6周耐力訓(xùn)練后，其骨骼肌 H IF-1αm RNA明顯上調(diào)，VEGF mRNA和肌紅蛋白mRNA表達(dá)也增加；而常氧狀態(tài)下則無顯著變化，研究提示低氧訓(xùn)練導(dǎo)致 H IF-1α mRNA表達(dá)增加不依賴于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的強(qiáng)度[14]，這在趙鵬等的研究中也得到了證實(shí)。他們的研究發(fā)現(xiàn)，高住高練、高住低練和持續(xù)低氧安靜組骨骼肌 H IF-1α表達(dá)都明顯增強(qiáng)，而低住低練和低住高練變化不大，復(fù)氧訓(xùn)練后回到常氧安靜水平，說明 H IF-1α表達(dá)與低氧（或缺氧）的程度和時(shí)間有明顯的依存關(guān)系[10]。劉文峰等研究發(fā)現(xiàn)，與安靜對(duì)照組相比，不論是單純低氧暴露、單純訓(xùn)練，還是高住低練都能促進(jìn)肝組織 HIF-1α的蛋白表達(dá)；高住低練過程中肝組織 H IF-1α蛋白表達(dá)高于單純低氧暴露或單純訓(xùn)練方式，不同持續(xù)時(shí)間低氧后運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝組織 HIF-1α蛋白表達(dá)的影響不同[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，低氧安靜、低住低練、高住高練、高住低練和低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)較常氧安靜組均有非常顯著性的升高（P＜0.01），其中，高住高練和低氧安靜組升高最為明顯分別達(dá)到866和802倍；而高住低練、低住高練、低住低練組則分別升高55、151和34倍，這提示，低氧和不同形式的運(yùn)動(dòng)均能影響機(jī)體肝組織 H IF-1αmRNA的表達(dá)。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織HIF-1αmRNA表達(dá)有非常顯著性的升高（達(dá)25.8倍，P＜0.01）；而高住低練、低住高練組肝組織則無明顯變化。并且，高住高練組肝組織 H IF-1αm RNA表達(dá)較高住低練、低住高練組均有非常顯著升高（分別達(dá)15.7和5.7倍，P＜0.01）；而高住低練組、低住高練組肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)較低氧安靜組均有非常顯著性降低（下降達(dá)93.8％和76.3％，P＜0.01）。

以上結(jié)果顯示，單純低氧、單純訓(xùn)練，以及不同模式低氧訓(xùn)練都能明顯誘導(dǎo)肝組織 HIF-1αmRNA的表達(dá)；持續(xù)低氧對(duì)肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)的影響比間歇低氧更為明顯，表現(xiàn)為高住高練較高住低練、低住高練影響更顯著，提示低氧和訓(xùn)練的雙重刺激對(duì)肝組織 HIF-1αmRNA表達(dá)產(chǎn)生更深刻的影響。

3.2 低氧訓(xùn)練對(duì)肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)的影響

HO是催化血紅素降解的始動(dòng)酶和限速酶，生成膽綠素、鐵和CO。HO系統(tǒng)存在3種亞型蛋白，它們分別為誘導(dǎo)型HO-1和結(jié)構(gòu)型 HO-2、HO-3。HO-1現(xiàn)已證明為人類熱應(yīng)激蛋白（HSP32），生理狀態(tài) HO-1表達(dá)是低水平的，但在各種刺激如血紅素、紫外線、缺氧、重金屬、細(xì)胞因子、炎癥因子等以及各種應(yīng)激狀態(tài)后，其表達(dá)很快上調(diào)。HO-2是一種結(jié)構(gòu)型基因，是生理狀態(tài)下 HO的主要存在形式。HO-3與HO-2有著約90％的同源性，但缺乏催化活性，其生物學(xué)特性和功能有待于進(jìn)一步研究[8，16]。

多數(shù)研究結(jié)果表明，CO在細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。特別是與運(yùn)動(dòng)能力緊密相關(guān)的心血管系統(tǒng)， CO通過激活sGC來誘導(dǎo)血管平滑肌的舒張，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等作用；促進(jìn)VEGF的合成；抑制血小板的黏附和聚集，調(diào)節(jié)血壓、改善主動(dòng)脈血流等作用[6，9]。

另有研究表明，CO能提高機(jī)體的免疫保護(hù)能力，抑制多種因素引起的細(xì)胞凋亡，以及提高機(jī)體應(yīng)激能力和自身保護(hù)能力。周君琳等報(bào)道，HO活性和CO生成量的增多可減輕大鼠肢體缺血再灌注所致的肺損傷[12]。

多數(shù)研究已經(jīng)證實(shí)，H IF-1α對(duì) HO-1的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，主要通過作用于血管平滑肌細(xì)胞 HO-1基因，產(chǎn)生HO-1，催化產(chǎn)生CO。CO以氣體信使的身份激活鳥苷酸環(huán)化酶，從而實(shí)現(xiàn)生理功能[5，16]。

趙鵬等的研究表明，持續(xù)低氧和間歇低氧均有提高骨骼肌 HO-1 mRNA表達(dá)的趨勢(shì)，其中，高住高練和低住高練最有利于 HO-1表達(dá)增強(qiáng)；常氧安靜、間歇低氧安靜、低住低練和低住高練組骨骼肌 HO-1表達(dá)主要在細(xì)胞膜上，而持續(xù)低氧安靜、高住高練、低住高練、低氧訓(xùn)練后復(fù)氧訓(xùn)練組 HO-1表達(dá)卻主要在胞漿中[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與常氧安靜對(duì)照組相比，高住低練組肝組織HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；低氧安靜、低住低練、高住高練和低住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)則均有非常顯著升高（分別達(dá)551、322、875和324倍，P＜0.01）。

與低住低練組相比，高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高（2.7倍，P＜0.05）；高住低練、低住高練組則無明顯變化；且高住高練組肝組織 HO-1 mRNA表達(dá)較高住低練組、低住高練組均有顯著升高（分別達(dá)2.2和2.7倍，P＜0.05）。

上述結(jié)果顯示，肝組織HO-1 mRNA的表達(dá)與 HIF-1α mRNA的表達(dá)有高度的一致性，單純低氧、單純訓(xùn)練和不同模式低氧訓(xùn)練均引起肝組織 HO-1 m RNA表達(dá)的升高；與低住低練相比，3種低氧訓(xùn)練模式中，僅高住高練明顯影響肝組織HO-1 mRNA的表達(dá)，高住低練和低住高練無顯著影響。

4 結(jié)論

1.單純低氧、單純訓(xùn)練和不同模式低氧訓(xùn)練均能顯著提高肝組織H IF-1α、HO-1 m RNA的表達(dá)，有利于改善特殊情況下內(nèi)臟器官的血液供應(yīng)。

2.高住高練對(duì)肝組織 HIF-1α、HO-1 mRNA表達(dá)的影響較低住低練、高住低練和低住高練更為明顯，提示機(jī)體為應(yīng)對(duì)雙重刺激，產(chǎn)生更為深刻的適應(yīng)性反應(yīng)。

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