維生素K缺乏時鼠尿理化性質(zhì)的改變與尿結(jié)石形成的關(guān)系

趙建軍 陳鵬杰 楊海平 李 磊

(河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，河北 邯鄲 056002)

尿結(jié)石的形成是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程，是一種世界范圍的常見病和多發(fā)病，發(fā)病率呈上升趨勢。尿結(jié)石的形成原因至今尚未完全清楚，一般認(rèn)為它與尿液pH、尿道感染、礦物質(zhì)代謝障礙等多種因素有關(guān)［1］。

尿結(jié)石的形成與尿液中大分子蛋白質(zhì)的性質(zhì)明顯相關(guān)，如尿凝血片段 1(urinary prothrombin fragment 1，UDTF1)是抑制尿中草酸鈣結(jié)晶的主要因子之一，是維生素K依賴性尿蛋白，其氨基末端的10～12個γ-羧基谷氨酸(Gla)殘基是其強(qiáng)烈抑制草酸鈣結(jié)晶的分子基礎(chǔ)［2］。在以前的研究中，我們曾觀察到應(yīng)用維生素K拮抗劑-香豆素可以造成大鼠生成腎結(jié)石的傾向增加［3］。另外，我們對腎結(jié)石患者應(yīng)用維生素K后其尿中抑制草酸鈣結(jié)晶活性增加［4］，說明維生素K缺乏可能改變UDTF1分子氨基酸構(gòu)成，與腎結(jié)石形成有關(guān)。但維生素K缺乏時尿液理化性質(zhì)的變化，以及此變化與腎結(jié)石形成的關(guān)系，國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道，值得進(jìn)一步研究。

在本實(shí)驗(yàn)中我們通過成功建立維生素K缺乏的實(shí)驗(yàn)動物模型，以期觀察維生素K缺乏時大鼠尿液理化性質(zhì)的變化，探討此變化與腎結(jié)石形成的關(guān)系，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar雄性大鼠40只(體質(zhì)量180～220 g)，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號:黑醫(yī)動證字09-032號。飼養(yǎng)條件:溫度為18～29℃，相對濕度40% ～70%，每h換氣次數(shù)10～20次，噪聲60 db以下。

1.1.2 藥品 誘石劑飲水采用飲水中加0.6%乙二醇及0.6%氯化銨，均購于哈爾濱市試劑公司。維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)。

1.2.3 飼料配方 采用AIN93M(the American Institute of Nutrition-for adult rat maintenance)飼料配方，各種飼料成分均購于哈爾濱市試劑公司。從中去除維生素K成分來制作無維生素K飼料。因豆油中含有維生素K，故本實(shí)驗(yàn)中采用玉米油代替。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及飼養(yǎng) 將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為4組，即對照組(A組)(含維生素K飼料和普通飲水)、無維生素K飼料組(B組)(無維生素K飼料和普通飲水)、誘石劑飲水組(C組)(含維生素K飼料和誘石劑飲水)、無維生素K飼料誘石劑飲水組(D組)(無維生素K飼料和誘石劑飲水)，每組10只。

1.2.2 大鼠尿液理化指標(biāo)的測定 所用鼠尿?yàn)轱曫B(yǎng)第3周末開始代謝籠飼養(yǎng)，收集24 h尿，加1%疊氮鈉4℃保存待用，共1周。應(yīng)用PHS-2C型數(shù)字顯示酸度計(jì)測定尿pH值，乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法測定尿鈣量，變色酸比色法測定尿草酸含量。

1.2.3 高壓液相法測定血漿中維生素K1水平 飼養(yǎng)4周后，水合氯醛腹腔注射麻醉，股動脈采血2 mL/只，低速離心(1 200 r/min)15 min，吸取血漿，立即避光封存于-70℃冰箱中。從-70℃冰箱中取出樣品，待融化后，離心(3 500 r/min 10 min)，取上清液 0.5 mL 加甲醇 0.5 mL，混勻2 min，再加入5 mL正己烷混勻5 min，再次離心(3 500 r/min 5 min，離心后棄去己烷層，取甲醇層置于微量離心管中，最后離心(10 000 r/min 5 min)，取上清液通過進(jìn)口一次性微量過濾器(0.22 μm)過濾，稀釋10倍，取5 μL上機(jī)測樣。整個過程較嚴(yán)格在避光條件中進(jìn)行，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 10 μg/mL=10 ng/μL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。用單因素方差分析法進(jìn)行組間差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿中維生素K1水平的比較 見表1。

表1 各組血漿中維生素K1水平的比較 nmoL/L

由表1可見，大鼠血漿中維生素K1的水平無維生素K飼料組明顯低于對照組(P＜0.001)，無維生素K飼料誘石劑飲水組明顯低于誘石劑飲水組(P＜0.001)。

2.2 各組尿量、尿鈣、尿草酸及尿pH比較 見表2。

表2 各組尿量、尿鈣、尿草酸及尿pH比較

表2 各組尿量、尿鈣、尿草酸及尿pH比較

與 A 組比較，*P ＜0.005，＊＊ P ＜0.001

組 別 尿量(mL/24 h)尿鈣(mmoL/24 h)尿草酸(mmoL/24 h) 尿pH A組22.72 ±1.89 1.52 ±0.15 15.05 ±1.54 7.93 ±0.35 B 組 44.23 ±4.85＊＊ 2.36 ±0.21＊＊ 19.73 ±1.27* 6.32 ±0.11*C 組 13.63 ±0.94＊＊ 2.66 ±0.13＊＊ 23.53 ±1.13* 5.65 ±0.23*D 組 13.69 ±1.44＊＊ 2.71 ±0.38＊＊ 26.99 ±1.51* 5.21 ±0.27*

由表2可見，無維生素K飼料組24 h尿量較對照組明顯增加(P＜0.001)，誘石劑飲水組和無維生素K飼料誘石劑飲水組與對照組相比明顯減少(P＜0.001);鼠尿中24 h尿鈣排出量無維生素K飼料組、無維生素K飼料誘石劑飲水組及誘石劑飲水組與對照組相比均明顯增加(P＜0.001);鼠尿中24 h尿草酸排出量無維生素K飼料組、誘石劑飲水組及無維生素K飼料誘石劑飲水組與對照組比較明顯增加(P＜0.005);大鼠尿pH值無維生素K飼料組、誘石劑飲水組及無維生素K飼料誘石劑飲水組與對照組比較均降低(P＜0.005)，顯示無維生素K飼料組、誘石劑飲水組及無維生素K飼料誘石劑飲水組3組尿液均酸化，且程度按無維生素K飼料組→誘石劑飲水組→無維生素K飼料誘石劑飲水組依次逐漸加重。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)采用美國營養(yǎng)學(xué)會AIN-93M實(shí)驗(yàn)性大鼠的飼料配方，從中去除維生素K成分，并且將飼料配方中的豆油用玉米油代替，因豆油含有維生素K成分，限制外源性維生素K的攝入，并且輔以每日2次清除大鼠糞便加上大鼠尾部糞套方法，限制內(nèi)源性維生素K合成。造成維生素K缺乏模型，并通過高壓液相檢驗(yàn)血漿中的維生素K1水平來證實(shí)。

維生素K缺乏時，大鼠的尿量明顯增加，提示腎小管的重吸收功能減弱，間接提示腎小管的受損。在同樣應(yīng)用誘石劑的情況下，2組實(shí)驗(yàn)大鼠的尿量無差別，但較正常對照組明顯減少，提示在誘石劑喂養(yǎng)下造成腎小管的重度損傷。

尿鈣是僅次于草酸的一種重要的成石因子，正常飲水時維生素K缺乏組，大鼠尿鈣的排出量增加顯著，結(jié)果提示:第一，維生素K參與全身鈣代謝，缺乏時全身骨脫鈣，但脫鈣的后果是尿中鈣濃度的升高，尿中鈣排泄的增加卻是造成腎結(jié)石形成的一個重要因素;第二，當(dāng)維生素K缺乏時，全身的羧化水平降低，造成依賴維生素K羧化的尿蛋白結(jié)構(gòu)和功能的異常，進(jìn)而造成尿液中晶體對腎小管上皮的損傷，損傷后鈣的回吸收減少。兩者結(jié)合更易導(dǎo)致晶體對腎小管的損害與黏附，從而形成結(jié)石。當(dāng)給予誘石劑飲水時，2組大鼠尿鈣的排出量無差別。但與正常組比較尿鈣的排出量顯著增加，說明鈣代謝的極度異常。

尿草酸是非常重要的成石因子，其成石作用是尿鈣的10倍，所以尿中草酸濃度的增加對于草酸鈣結(jié)石的形成具有重要意義［5-6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在正常飲水的情況下，缺乏維生素K的實(shí)驗(yàn)組，草酸的排出量明顯高于對照組，草酸的排出增加。在同時誘石劑飲水情況下，缺乏維生素K組草酸的排出量高于無缺乏組，進(jìn)一步說明維生素K存在情況下，腎小管的上皮組織有自然的保護(hù)機(jī)制，在同樣的誘石劑損傷因子存在時，正常飲食的大鼠腎小管受損較輕。

缺乏維生素K的實(shí)驗(yàn)組尿pH值低于對照組。誘石劑飲水的實(shí)驗(yàn)組，維生素K缺乏與否，其pH值的差異同樣顯著。酸性尿有利于結(jié)石的形成，缺乏維生素K時，尿的酸性加強(qiáng)，說明此時有利于結(jié)石的形成

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素K缺乏時鼠尿理化性質(zhì)的變化有著明顯的結(jié)石形成傾向，可能是由于依賴維生素K尿蛋白分子結(jié)構(gòu)的異常所致，尿蛋白分子結(jié)構(gòu)異常與鼠尿理化性質(zhì)的變化可能存在一定的相關(guān)性。

［1］Robertson WG，Jones JS，Heaton MA，et al.Predicting the crystallization potential of urine form cats and dogs with respect to calcium oxalate and magnesium ammonium phosphate(struvite)［J］.The journal of Nutrition Bethesda，2002，132(6S):1637-1641.

［2］陳俊匯，劉繼紅，章詠裳，等.草酸鈣尿結(jié)石患者腎組織維生素K依賴羧化酶活性的研究［J］.中華泌尿外科雜志，2002，23(12):725-727.

［3］安瑞華，馮陶，沈紹基，等.香豆素對實(shí)驗(yàn)性大鼠草酸鈣結(jié)石形成的影響［J］.中華泌尿外科雜志，1994，15(3):209-212.

［4］安瑞華，李勇強(qiáng)，祁尤成，等.維生素K對腎結(jié)石患者尿抑制作用的影響［J］.中華泌尿外科雜志，1998，19(8):460-462.

［5］Smith LH.Diet and hyperoxaluria in the syndrome of idiopathic calcium oxalate urolithiasis［J］.Am J Kidney Dis，1991，17(4):370-375.

［6］Sigmon D，Kumar S，Carpenter B，et al.Oxalate transport in renal tubular cells from normal and stone-forming animals［J］.Am J Kidney Dis，1991，17(4):376-380.