芹菜素對大鼠阿霉素性心肌損傷的影響

王 仙,于肯明

阿霉素(Adriamycin,ADR)屬于蒽環(huán)類抗生素,廣泛應(yīng)用于急、慢性白血病,淋巴瘤以及各種實(shí)體瘤的治療過程中。但是,隨著阿霉素使用的增加,急慢心肌損傷成為其臨床應(yīng)用的主要障礙[1,2]。芹菜素(Apigenin,API)是一種黃酮類化合物,廣泛存在于各種水果、蔬菜和某些植物中,具有神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。越來越多的研究提示,芹菜素可通過多種途徑發(fā)揮對心血管系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用[3-5]。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠阿霉素性急性心肌損傷模型,來觀察芹菜素在大鼠阿霉素性心肌損傷中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品、試劑、儀器 阿霉素,浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號(hào):20081107);芹菜素,陜西慧科植物開發(fā)有限公司(批號(hào):AP20070823);T LR4免疫組化試劑盒,購自武漢博士德生物工程公司;CK-MB的ELISA檢測試劑盒,購自上海越研生物科技有限公司。顯微鏡及圖形分析系統(tǒng)、多功能酶標(biāo)儀等。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只,清潔級(jí),體重200 g～250 g,由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理 雄性SD大鼠40只,隨機(jī)分為5組(每組8只):CONT ROL、ADR、ADR+API[L]、ADR+API [M]、ADR+API[H]。ADR+API各組于實(shí)驗(yàn)開始的第一天起每天分別腹腔注射7.5 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg的芹菜素,共5 d;CONTROL組和ADR組每天注射等體積的生理鹽水,共5 d;除CONT ROL組外,其他實(shí)驗(yàn)組均于實(shí)驗(yàn)的第6天一次性腹腔注射15 mg/kg阿霉素。CONT ROL組注射等體積的生理鹽水。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)第8天采血后使用斷頭法處死。

1.2.2 病理組織學(xué)觀察 剪取部分游離左室壁組織,10%甲醛固定;常規(guī)石蠟包埋,切片4μ m。取制作好的切片,HE染色,光鏡下作組織病理學(xué)觀察。

1.2.3 心肌細(xì)胞TLR4的免疫組化檢測 取制作好的石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,0.1%胰蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù),以TLR4一抗4℃過夜,二抗室溫孵育, DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。免疫組化陽性反應(yīng)為細(xì)胞漿內(nèi)具有棕黃色顆粒沉積。在400倍的視野下,每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)位點(diǎn),對其染色強(qiáng)度進(jìn)行自動(dòng)分析,結(jié)果用灰度值表示。

1.2.4 血清心肌酶檢測 嚴(yán)格按照CK-MB的ELISA試劑盒說明操作,按序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣、溫育、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色等。

2 結(jié) 果

2.1 心肌組織光鏡下病理形態(tài)學(xué)觀察 在光鏡下,CONTROL組心肌細(xì)胞排列整齊,橫紋清晰可見,細(xì)胞間隙正常;ADR組的心肌細(xì)胞橫紋模糊消失,心肌纖維出現(xiàn)扭曲、斷裂,細(xì)胞間隙明顯增寬;ADR+API各組,中劑量、高劑量組心肌損傷表現(xiàn)明顯改善,心肌纖維斷裂的程度明顯輕于ADR組,而低劑量組表現(xiàn)不是很明顯。

2.2 心肌細(xì)胞TLR4免疫組化灰度值(GREY)變化 與CONTROL組比較,ADR組的GREY值明顯降低(P＜0.01);與ADR組比較,ADR+API各組的GREY值升高,ADR+API (L)組的GREY值升高不明顯;ADR+API(M)與ADR+API (H)兩組的GREY值升高明顯(P＜0.01)。詳見表1。

2.3 血清心肌酶CK-MB改變 與CONTROL組相比較, ADR組的CK-MB值明顯升高(P＜0.01);與ADR組相比較, ADR+API各組的CK-MB值降低,ADR+API(L)組的CK-MB值降低不明顯;ADR+API(M)與ADR+API(H)兩組的CK-MB值降低明顯(P＜0.01)。詳見表1。

表1 芹菜素對G REY,CK-M B變化的影響( ±s)

表1 芹菜素對G REY,CK-M B變化的影響( ±s)

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3 討 論

阿霉素是一種抗瘤活性強(qiáng)的蒽環(huán)類化療藥物,目前被廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療。當(dāng)阿霉素累積量＞550 mg/m-2時(shí),心衰發(fā)生率高達(dá)26%,而使用劑量達(dá)到700 mg/m2時(shí),心衰發(fā)生率高達(dá)48%[6]。探討阿霉素心肌損傷的機(jī)制,并尋求解決的辦法一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。阿霉素心肌損傷的機(jī)制可能涉及了多個(gè)方面,包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、基因及轉(zhuǎn)錄水平的改變等[7-10]。免疫炎性損傷可能在阿霉素心肌損傷中發(fā)揮了重要作用[11,12]。本實(shí)驗(yàn)采用給大鼠一次性腹腔注射阿霉素 15 mg/kg制備阿霉素急性心臟損傷模型[13],并探討芹菜素低(7.5 mg/kg)、中(15 mg/kg)、高(30 mg/kg)三個(gè)劑量對阿霉素急性心臟損傷的影響。給予大鼠一次性腹腔注射阿霉素15 mg/kg后,ADM組的大鼠心肌細(xì)胞,出現(xiàn)心肌纖維的扭曲和斷裂,而且在血清CK-M B、心肌細(xì)胞TLR4免疫組化檢測方面,ADR組與CONTROL組相比較,差異具有顯著性,表明阿霉素急性心臟損傷模型制作成功。而在提前給予5 d的芹菜素組,尤其ADM+API(M)與ADM+API(H)組的各項(xiàng)指標(biāo)均改善明顯,表明芹菜素可以減輕阿霉素所導(dǎo)致的心肌損傷。TLR4是近幾年發(fā)現(xiàn)可能參與許多心血管疾病的受體,Alexander等[12]發(fā)現(xiàn)TLR4基因敲除鼠,其多柔比星所造成的心肌損傷減輕,而且束進(jìn)等[14]通過在體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)損傷模型中發(fā)現(xiàn),多柔比星作用于乳鼠心肌細(xì)胞2 h、6 h后TLR4表達(dá)明顯增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示,與CON TROL組相比較,ADR組的TLR4表達(dá)明顯增高;與ADR組相比較,ADR+API(M)與ADR+API(H)兩組TLR4的表達(dá)明顯下降,提示阿霉素所導(dǎo)致的心臟損傷可能與TLR4的過度表達(dá)有關(guān)。

芹菜素可減輕阿霉素性心肌損傷,可能與其對心肌細(xì)胞TLR4表達(dá)的影響有關(guān),但其確切機(jī)制還有待于深一步研究。

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