蘆丁對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠免疫和抗氧化功能的影響

汶 希，潘華山，馮毅翀，劉 剛

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)體育健康學(xué)院，廣東 廣州510006）

運(yùn)動(dòng)與免疫之間的相互關(guān)系研究一直受到許多學(xué)者的廣泛重視．研究結(jié)果表明，適量運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的功能，提高機(jī)體免疫能力．流行病學(xué)調(diào)查顯示，長(zhǎng)時(shí)間或大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能會(huì)造成運(yùn)動(dòng)員對(duì)疾病的易感性增加，并且在疾病潛伏期訓(xùn)練或比賽還會(huì)加重發(fā)病癥狀［1］．優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員、教練員及隊(duì)醫(yī)也從實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)中體會(huì)到，頻繁比賽和高強(qiáng)度的訓(xùn)練會(huì)使運(yùn)動(dòng)員抵抗力下降，容易感染疾病，從而影響他們的運(yùn)動(dòng)能力，甚至中斷和退出訓(xùn)練、比賽．因而，探討改善或調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)后免疫功能的干預(yù)措施具有重要現(xiàn)實(shí)意義．

蘆丁 （rutin）分子式為C27H30O16，又稱蕓香苷 （rutinoside）、維生素P、紫槲皮苷，是槲皮素的3－O－蕓香糖苷，化學(xué)式見(jiàn)圖1，為一來(lái)源很廣的黃酮類化合物廣泛存在于自然界中［2］，幾乎所有的蕓香科和石楠科植物均含有蘆?。|香科的蕓香草、豆科的槐、蓼科的蕎麥、金絲桃科的紅旱蓮、鼠李科的光枝勾兒茶等植物含量較為豐富．蘆丁具有多種生理活性，藥用價(jià)值很高．常用于防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜、急性出血性腎炎、慢性氣管炎、血管脆性增加、血管滲透壓異常等病癥，同時(shí)還可預(yù)防和治療糖尿病及高脂血癥，蘆丁除能降低血脂、抗血小板聚集、抑制血管內(nèi)皮因子的釋放外，還能抑制基因突變，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)早幼粒細(xì)胞分化，提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率［3］．蘆丁對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的研究報(bào)道甚少［4］，體內(nèi)氧化還原反應(yīng)關(guān)系密切的肝細(xì)胞功能的影響也一直未得以闡明．為了深入探討蘆丁的免疫調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠耐力訓(xùn)練模型來(lái)觀察不同劑量的蘆丁對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，并從特異性免疫和非特異性免疫方面進(jìn)行了研究，為改善耐力訓(xùn)練引起的細(xì)胞免疫功能低下尋找有效的干預(yù)措施．

圖1 蘆丁的結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1．1 藥物和安慰劑的制備

蘆丁純度為98%，由南京替斯艾么中藥技術(shù)研究所提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)用蒸餾水配成所需濃度的混懸液．對(duì)照組采用同體積的雙蒸水，雙蒸水由德國(guó)GFL雙蒸水蒸餾設(shè)備提取．

1．2 動(dòng)物分組及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性Wistar大鼠45只，鼠齡8周，體重120～140 g，購(gòu)于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心．進(jìn)行跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練剔除不會(huì)跑、不愿跑的大鼠，篩選出39只大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)．溫度為21～24℃，濕度60%左右，晝夜節(jié)律用日光燈控制，每日光照時(shí)間12 h（8∶00～20∶00），大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只．標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物維持期飼料常規(guī)飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水．

分組：根據(jù)體重隨機(jī)將小鼠分為2組：對(duì)照組19只大鼠進(jìn)行耐力訓(xùn)練的同時(shí)每?jī)商煲噪p蒸水灌胃；蘆丁組20只大鼠通過(guò)灌胃給藥，給藥量為10 m L／kg，每天灌胃一次．

1．3 跑臺(tái)訓(xùn)練方法

目前，最為運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界認(rèn)可的大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型為：Bedford漸增負(fù)荷跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型［5］．Bedford通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，將大鼠跑臺(tái)的速度、時(shí)間、坡度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度聯(lián)系起來(lái)，規(guī)范了大鼠跑臺(tái)的量化指標(biāo)，其具體內(nèi)容：第一級(jí)負(fù)荷：0°，8．2 m／min，運(yùn)動(dòng)15 min （相當(dāng)于53%VO2MAX）；第二級(jí)負(fù)荷：10°，15 m／min，運(yùn)動(dòng)15 min （相當(dāng)于64%VO2MAX）；第三級(jí)負(fù)荷：15°，19．3 m／min，運(yùn)動(dòng)90 min （相當(dāng)于76%VO2MAX），總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為120 min，運(yùn)動(dòng)中采用毛刷刺激維持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度．隨著大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的廣泛應(yīng)用，又有研究使用如下方法：在坡度為0°的大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練，小強(qiáng)度訓(xùn)練組跑速15 m／min，訓(xùn)練時(shí)間40～60 min；中強(qiáng)度訓(xùn)練組跑速20～25 m／min，訓(xùn)練時(shí)間30～40 min；大強(qiáng)度訓(xùn)練組跑速30～35 m／min，訓(xùn)練時(shí)間20～30 min．因此在設(shè)置大鼠耐力訓(xùn)練模型時(shí)，本研究借鑒上述跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的設(shè)計(jì)，考慮本研究樣本量略大，研究動(dòng)物個(gè)體運(yùn)動(dòng)能力差異，擬選用同一速度：25 m／min，每次運(yùn)動(dòng)40 min，每周運(yùn)動(dòng)5天，持續(xù)4周，將運(yùn)動(dòng)控制在中高強(qiáng)度，以期模擬運(yùn)動(dòng)員平時(shí)運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)．

1．4 儀 器

723C型分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品．JD－3B多功能電子天平：由沈陽(yáng)龍騰電子有限公司提供．日本東芝TBA－10FR全自動(dòng)生化分析儀：（日本）東芝公司產(chǎn)品．

1．5 取樣及測(cè)試方法

4周訓(xùn)練結(jié)束后對(duì)照組和蘆丁組大鼠在最后一次訓(xùn)練停止后20 h左右用1．5 m L三氯乙醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血2 m L，肝素抗凝．一部分抗凝血用于外周血單個(gè)核細(xì)胞 （PBMC）的分離與培養(yǎng)，T細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定．剩下的部分靜置30 min后，2500 r／min離心10 min，取上清液體保存于小試管中，－20℃凍存待測(cè)．MDA采用TBA比色法 （硫代巴比妥酸），SOD采用黃嘌呤氧化酶法，GSH采用比色定量．白細(xì)胞介素采用放射免疫檢測(cè)法，在γ計(jì)數(shù)儀 （美國(guó)Beckman公司500型）上檢測(cè)IL－2，IL－6濃度．

1．5．1 外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定

取20μL全血，放入事先加好血細(xì)胞稀釋液試管 （1∶200稀釋）中，用Culhae MEK—6318K血細(xì)胞分析儀 （日本光電公司制造）測(cè)定WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)量，血細(xì)胞稀釋液 （批號(hào)040525）由日本光電工業(yè)株式會(huì)社授權(quán)生產(chǎn)．

1．5．2 T淋巴細(xì)胞數(shù)量測(cè)定

取20μL抗凝血，加入FITC標(biāo)記的抗大鼠CD3的單抗 （美國(guó)CALTAG公司產(chǎn)品）0．3μL，混勻，室溫避光孵育15 min．加入200μL1∶9稀釋的溶血?jiǎng)?（三和醫(yī)療設(shè)備有限公司公司產(chǎn)品），混勻，室溫避光孵育10 min．離心10 min后，棄上清．加血清、疊氮鈉等混勻，離心5 min后，棄上清，混懸細(xì)胞．加300μL PBS（含胎牛血清和1%多聚甲醛）混勻．在流式細(xì)胞儀上計(jì)數(shù)細(xì)胞，分析T細(xì)胞 （CD3＋）數(shù)量．

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2．1 補(bǔ)充蘆丁對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞及T細(xì)胞數(shù)的影響

在訓(xùn)練4周后，蘆丁組大鼠外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)和T細(xì)胞數(shù)均比對(duì)照組高．但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0．05）（見(jiàn)表1）．

表1 訓(xùn)練4周后大鼠外周血WBC和淋巴細(xì)胞及T淋巴數(shù)測(cè)試結(jié)果

2．2 補(bǔ)充蘆丁對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠血清MDA、GSH、SOD含量的影響

與對(duì)照組比較，蘆丁組血清MDA含量明顯降低 （P＜0．05），GSH含量升高（P＜0．05），血清SOD活力顯著升高 （P＜0．01）（見(jiàn)表2）．

表2 訓(xùn)練4周后大鼠血清MDA、GSH、SOD含量測(cè)試結(jié)果

2．3 補(bǔ)充蘆丁對(duì)耐力訓(xùn)練大鼠血漿白細(xì)胞介素濃度變化的影響

與對(duì)照組比較，蘆丁組IL－2濃度顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0．05）．運(yùn)動(dòng)后20 h蘆丁組大鼠血漿IL－6水平比對(duì)照組顯著下降 （P＜0．01），由此可以推斷補(bǔ)充蘆丁能緩解運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)后IL－6升高 （見(jiàn)表3）．

表3 訓(xùn)練4周后大鼠血漿白細(xì)胞介素濃度的變化

3 討 論

本研究表明4周耐力訓(xùn)練后，單純運(yùn)動(dòng)組6周大鼠外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)、T細(xì)胞數(shù)下降，與外國(guó)學(xué)者的研究結(jié)果類似［5］，補(bǔ)充蘆丁在運(yùn)動(dòng)后均維持在較高水平．大量的研究已經(jīng)證明：淋巴細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中濃度升高，運(yùn)動(dòng)后反而下降，并低于運(yùn)動(dòng)前水平［6－8］．故我們推斷，耐力訓(xùn)練過(guò)程中，由于自由基濃度升高，引起外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞膜損傷或破裂，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致數(shù)量減少．Hung等研究證實(shí)蘆丁的抗氧化作用強(qiáng)于維生素E及維生素C［9］．并能清除自由基，尤其是羥自由基，使DNA免受損傷，我們推測(cè)補(bǔ)充蘆丁在運(yùn)動(dòng)后維持外周血WBC、淋巴細(xì)胞數(shù)、T細(xì)胞數(shù)無(wú)太大波動(dòng)，也與這個(gè)原因有關(guān)．

MDA含量可反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的速率和強(qiáng)度，間接反映細(xì)胞的損傷程度，其含量越高，生物膜破壞越嚴(yán)重．試驗(yàn)中蘆丁組可顯著降低MDA含量，使其恢復(fù)到正常水平，這與大鼠體內(nèi)抗氧化能力增強(qiáng)有關(guān)．谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 （GSH－Px）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過(guò)氧化物分解酶，能同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解［10］，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過(guò)氧化物的干擾及損害．SOD可清除自由基，減輕和阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)機(jī)體免受自由基損傷．補(bǔ)充蘆丁后GSH、血清SOD活性增高、MDA含量下降提示：蘆丁可以使體內(nèi)抗自由基能力提高，蘆丁是一種天然抗氧化劑，夏維木等發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)O2－有很強(qiáng)的清除作用，清除效率可達(dá)96%以上［11］．蘆丁作為Fe2＋的螯合劑，能抑制Fenton（芬頓）反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)而具有明顯的抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用［12］．

IL－2主要以自分泌或旁分泌方式發(fā)揮效應(yīng)．IL－2是輔助T淋巴細(xì)胞受抗原或分裂原刺激產(chǎn)生的一種糖蛋白，有促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化和增殖，提高NK細(xì)胞活性的作用．IL－6本屬于前炎性細(xì)胞因子，但在應(yīng)激狀態(tài)下也有整體調(diào)節(jié)作用．劇烈運(yùn)動(dòng)后，這兩種細(xì)胞因子可成倍增加［14］如，馬拉松比賽后，IL－6的血清濃度增加值高達(dá)安靜值的50倍［15］．本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，蘆丁組IL－2濃度顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．運(yùn)動(dòng)后20 h蘆丁組大鼠血漿IL－6水平比對(duì)照組顯著下降，由此可以推斷補(bǔ)充蘆丁能緩解運(yùn)動(dòng)大鼠運(yùn)動(dòng)后IL－6升高，抑制進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)．

4 結(jié) 論

4．1 補(bǔ)充蘆丁可使大鼠耐力訓(xùn)練后外周血WBC和淋巴細(xì)胞及T細(xì)胞數(shù)下降幅度減低，由此可推斷蘆丁可防止大鼠后耐力訓(xùn)練外周血WBC和淋巴細(xì)胞數(shù)顯著下降．

4．2 補(bǔ)充蘆丁可以使大鼠耐力訓(xùn)練后血清MDA含量明顯降低，GSH含量升高，血清SOD活力比對(duì)照組顯著升高．由此推斷蘆丁可以使體內(nèi)抗自由基能力提高，通過(guò)酚羥基和羰基的轉(zhuǎn)換，可提供氫原子而終止自由基連鎖反應(yīng)，以保護(hù)細(xì)胞完整性，因此其具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞的功能．

4．3 補(bǔ)充蘆丁可以使耐力訓(xùn)練大鼠IL－2濃度顯著增加，血漿IL－6水平比對(duì)照組顯著下降，由此可以推斷補(bǔ)充蘆丁能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分化和增殖，緩解運(yùn)動(dòng)大老鼠運(yùn)動(dòng)后IL－6升高，抑制進(jìn)一步的炎癥反應(yīng)．

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