Sphk-1在人腦膠質(zhì)瘤中表達的研究

李 強,許海洋,佟 倩,張顯峰*,于洪泉,姜云鵬,張永海

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 神經(jīng)外科,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院心血管內(nèi)科,吉林 長春 130021;3.吉林大學(xué)病理解剖學(xué)教研室,吉林 長春 130021）

惡性膠質(zhì)瘤是一種高侵襲性,低生存率的顱內(nèi)腫瘤,但對于其診斷治療手段仍然未取得有效進展。由于腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及侵襲性都是脂質(zhì)介導(dǎo)的信號事件。所以近年來,脂肪生成/脂質(zhì)代謝在惡性腫瘤研究中已經(jīng)引起越來越多的學(xué)者的關(guān)注。磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK-1）作為一種脂質(zhì)酶,而S1P作為其催化底物,與人類多種癌癥存在著必然的聯(lián)系。國外研究表明:SphK-1具有強有力的致瘤性和促血管生成作用,在多種癌細胞中SphK-1 mRNA的表達皆被上調(diào)。本文采取免疫組化法檢測SphK-1在正常腦組織和人腦膠質(zhì)瘤細胞中的陽性表達率,探討其與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系及作為治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料 兔抗人Sphk1抗體（濃縮型）,由上海晶天生物有限公司提供;免疫組化試劑盒,由福州邁新有限公司提供;本實驗所使用的10例腦出血患者正常腦組織及人腦膠質(zhì)瘤石蠟組織標(biāo)本62例收集于吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科2008年9月-2010年4月外科手術(shù)中。其中原發(fā)55例,復(fù)發(fā) 7例;男性 35例,女性27例;年齡10-72歲,平均40.50歲。參照2000年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類、分級標(biāo)準(zhǔn),低級別膠質(zhì)瘤（Low grade glioma,LGG,Ⅰ、Ⅱ級）28例,其中包括:星形細胞瘤12例,混合少突星形細胞瘤13例,室管膜瘤3例;高級別膠質(zhì)瘤（High grade glioma,HGG,Ⅲ、Ⅳ級）34例,其中包括:間變性星形細胞瘤11例,間變性少突星形細胞瘤9例,間變性室管膜瘤2例;星形細胞里Ⅳ級4例,少突星形細胞瘤Ⅳ級3例,膠質(zhì)母細胞瘤5例。術(shù)前均未接受放療或化療。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法對此10例正常腦組織及62例人腦膠質(zhì)瘤進行一系列的石蠟包埋及染色,然后應(yīng)用SphK-1抗體進行染色,在高倍顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果分析 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)如下[1]:SphK-1蛋白染色陽性表現(xiàn)為細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕褐色顆粒。在400倍視野下,隨機選擇10個視野,計數(shù)100個細胞,分別計算陽性細胞數(shù)及其表達率。根據(jù)陽性細胞率及染色強度按下述標(biāo)準(zhǔn)分級:①陰性（-）,隨機視野中陽性細胞數(shù)小于10%;②弱陽性（+）,胞漿內(nèi)均勻分布淺棕褐色反應(yīng),陽性細胞數(shù)10%-25%;③中等陽性（++）,深棕褐色反應(yīng),陽性細胞數(shù)25%-50%;④強陽性（+++）,棕黑色反應(yīng),胞漿內(nèi)呈粗大顆?；驂K狀著色,陽性細胞數(shù)＞50%。

1.2.3 統(tǒng)計分析 根據(jù)數(shù)據(jù)采集的不同方法及統(tǒng)計學(xué)處理的不同要求,選用χ2檢驗及spearman相關(guān)系數(shù)檢驗,使用統(tǒng)計軟件SPSS 10.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 Sphk-1的染色結(jié)果 正常腦組織及21例膠質(zhì)瘤細胞中未檢測到Sphk-1的表達,41例腫瘤組織中可見細胞質(zhì)染色陽性,為棕褐色顆粒。見圖1、圖2。

圖1 膠質(zhì)瘤Ⅰ-Ⅱ級的病理結(jié)果（40×10）

圖2 膠質(zhì)母細胞瘤的病理結(jié)果（40×10）

2.2 免疫組化染色結(jié)果 本組Sphk-1在膠質(zhì)瘤中的總陽性表達率為66.1%。膠質(zhì)瘤與正常腦組織之間,各組間兩兩比較,應(yīng)用 χ2檢驗,差異均有顯著性（P＜0.01）,通過spearman相關(guān)系數(shù)檢驗,r=0.748,P＜0.01,表明SphK-1與人腦膠質(zhì)瘤的分級存在相關(guān)性。Sphk-1蛋白的表達水平與膠質(zhì)瘤病理級別具有相關(guān)性。隨著膠質(zhì)瘤級別的升高,Sphk-1蛋白表達明顯增高。見表1。

表1 SphK-1在人腦正常腦組織及膠質(zhì)瘤中的表達

3 討論

膠質(zhì)細胞瘤為神經(jīng)上皮性腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的45%,根據(jù)腫瘤細胞的分化情況可分為:髓母細胞瘤、星形細胞瘤、少枝膠質(zhì)細胞瘤、多形性膠質(zhì)母細胞瘤和室管膜瘤,髓母細胞瘤[2]。惡性膠質(zhì)細胞瘤進展快,導(dǎo)致其患者的愈后效果較差,相關(guān)報道認為:對膠質(zhì)瘤的治療多年來仍然沒有重大進展,其一年生存率僅為30%,并且其總的生存時間不超過53周。即使應(yīng)用外科手術(shù)、放化療等多種治療手段效果仍不明顯。如此低的生存率很大程度上與膠質(zhì)瘤的高侵蝕性有密切關(guān)系[3]。

眾所周知,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與細胞周期失調(diào)控、細胞異常增殖相關(guān)。最近的研究表明,脂肪生成/脂質(zhì)代謝在癌癥研究中已經(jīng)引學(xué)者的廣泛關(guān)注。首先,脂質(zhì)是細胞膜的重要組成部分。其次,癌細胞的增長迅速,需要消耗大量的能量。再次,參與惡性腫瘤進展的重要的生物過程（如:細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成等）都是脂質(zhì)介導(dǎo)的信號事件[4]。而磷酸鞘氨醇激酶-1（SphK）作為一種脂質(zhì)酶,與其催化底物S1P,與人類多種癌癥有著著必然的聯(lián)系。研究還發(fā)現(xiàn),在人體多種惡性腫瘤中SphK-1mRNA的表達皆被上調(diào)[5]。

鞘氨醇激酶-1（sphingosine kinase 1,SphK-1）是一種與細胞生命活動密切相關(guān)的鞘氨醇代謝酶[6],在體內(nèi)發(fā)揮著廣泛的生物學(xué)功能。作為體內(nèi)重要的脂質(zhì)之一,鞘氨醇（sphingosine）可由SphK-1催化成為促生長因子1-磷酸鞘氨醇（S1P）,也可由神經(jīng)酰胺合成酶催化生成促凋亡因子-神經(jīng)酰胺（ceramide）,S1P/ceramide的平衡是決定細胞生存或凋亡的重要因素,而SphK-1是調(diào)節(jié)這一平衡的關(guān)鍵酶。SphK-1表達增加不僅導(dǎo)致S1P水平升高,改變S1P/ceramide的平衡,從而對抗細胞凋亡,還能增加細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化的速率,進而促進細胞生長。同時S1P還發(fā)揮著第二信使的作用[7]。國外動物實驗研究表明[8]:SphK-1的缺失將使細胞周期停滯,增加促凋亡蛋白Bax在線粒體膜上的積聚,激活細胞凋亡的胞內(nèi)途徑,從而促使細胞凋亡。

國內(nèi)外大量研究表明[9]:SphK-1在乳腺癌、結(jié)腸癌及胃癌等體內(nèi)多種惡性腫瘤中表達顯著增加。而對于其在顱內(nèi)腫瘤中表達的研究卻較少,Nicholas Young[10]等在研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在膠質(zhì)母細胞瘤中顯著表達,進而刺激其腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。DongHoon Lee等[11]、中山大學(xué)的Li Jun等[12]在對大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)SphK-1在星形細胞瘤中表達顯著,并且隨惡性程度的增加而表達增強。但就SphK-1在各型膠質(zhì)瘤中的表達的研究卻沒有。在本次試驗中我們就SphK-1在多種膠質(zhì)細胞瘤中的表達進行研究。我們發(fā)現(xiàn)SphK-1蛋白的表達主要位于細胞漿內(nèi),其在膠質(zhì)瘤中的陽性表達率明顯高于正常腦組織,應(yīng)用spearman相關(guān)系數(shù)檢驗,P＜0.01,提示SphK-1表達增強與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。SphK-1在低級別膠質(zhì)瘤與高級別膠質(zhì)瘤的表達有顯著差異性（P＜0.05）,同時在本次實驗中,我們根據(jù)病理分級把腫瘤標(biāo)本分為三組,比較各級別膠質(zhì)瘤中SphK-1的表達后發(fā)現(xiàn)差異存在顯著性（P＜0.05）?？梢奡phK-1的表達隨腫瘤惡性程度的升高而增強,推測SphK-1可能參與了膠質(zhì)瘤的惡性進展。因此,抑制SphK-1的生成可能減緩腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

根據(jù)本實驗結(jié)果及結(jié)合相關(guān)文獻報道,我們認為在膠質(zhì)瘤中SphK-1可促進腫瘤的生長及侵襲,增加腫瘤的惡性程度,進而降低腫瘤的愈后效果,至于其具體機制尚有待進一步研究。同時我們考慮針對SphK-1應(yīng)用基因技術(shù)或抗體免疫反應(yīng)在不久的將來可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。

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