25例慢性心力衰竭患者炎癥細(xì)胞因子的變化

劉家勉,劉應(yīng)才

（1.四川省樂山市人民醫(yī)院心內(nèi)科 614000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川646000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）的機制目前尚未完全清楚。近年來發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞因子的大量分泌以及核因子-κ B（NF-κ B）的活化在CHF的發(fā)生和發(fā)展中起十分重要的促進(jìn)作用[1-7]。本文通過對CHF患者外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）在脂多糖（LPS）的刺激下進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察CHF患者PBMCs分泌細(xì)胞因子水平和NF-κ B活性的變化,以及兩者的關(guān)系,從而探討CHF的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科2007年6月至2007年12月住院的CHF組患者25例,其中男18例,女7例,年齡（61.3±10.1）歲。心功能NYHA分級Ⅲ～Ⅳ級,Ⅲ級19例,Ⅳ級6例,經(jīng)超聲心動圖測定LVEF＜45%。擴張性心肌病16例,缺血性心肌病5例（有典型心絞痛表現(xiàn)或經(jīng)冠狀動脈造影明確有冠狀動脈病變）,高血壓性心臟病4例；病程6個月至12年。健康對照組25例,其中男18例,女7例,年齡（60.4±9.6）歲,為瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診健康體檢者。兩組均排除風(fēng)濕活動、自身免疫性疾病、腫瘤、感染、糖尿病等。近1周未服用β受體阻滯劑,已服用者需停藥1周以上。

1.2 實驗材料 Ficoll hypaque淋巴細(xì)胞分離液（上海華精生物高技有限公司產(chǎn)品）,胎牛血清（GIBCO公司）,PRMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）,白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）放射免疫試劑盒（解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所）,LPS（Sigma公司）,NF-κ B p65試劑盒（武漢博士德公司）等。

1.3 實驗方法 CHF患者及健康體檢者抽取空腹12h肘靜脈血5mL,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll hypaque,密度為1.077）分離單個核細(xì)胞,用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（含2mmoL谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μ g/mL鏈霉素）懸浮細(xì)胞,加入24孔培養(yǎng)板。置入37℃、5%CO2飽和濕度的孵育箱中,2h后加入LPS（1μ g/mL,細(xì)胞終濃度為1× 106個/升）。刺激24h后應(yīng)用放射免疫法測定培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平,留取PBM Cs檢測NF-κ B活性。

1.4 細(xì)胞因子檢測 培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α檢測采用解放軍總醫(yī)院放免所試劑盒,由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科協(xié)助測定。

1.5 NF-κ B檢測 將培養(yǎng)后離心的PBMCs加入完全培養(yǎng)基洗滌兩次,每次以1000r/min離心10min,末次離心后的細(xì)胞加入完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×107個/毫升,用毛細(xì)吸管吸取30μ L細(xì)胞懸液涂于用多聚賴氨酸處理過的玻片上,室溫風(fēng)干。將細(xì)胞涂片用純丙酮固定30min,再次風(fēng)干后將標(biāo)本置于-70℃冰箱中保存待測。PBMCs NF-κ B免疫組化染色使用武漢博士德生物工程有限公司的NF-κ B p65試劑盒,采用生物素-鏈霉親和素免疫組化染色法。NF-κ B活性檢測：隨機選取5個高倍視野,細(xì)胞核呈棕黃色定為NF-κ B陽性細(xì)胞,共計500個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞占總計細(xì)胞的百分率。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞因子水平及NF-κ B活性比較 CHF組各細(xì)胞因子水平及NF-κ B活性均明顯升高,見表1、封3圖1。

表1 兩組細(xì)胞因子及NF-κ B活性

2.2 相關(guān)性分析 PBMCs NF-κ B陽性細(xì)胞率與培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈顯著正相關(guān),見表2。

表2 PBMCs NF-κ B陽性細(xì)胞率與細(xì)胞因子相關(guān)性

3 討論

CHF患者外周血中以及心肌局部有大量的炎性細(xì)胞因子分泌[8]。炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β可通過一系列調(diào)控機制,如促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、左室重塑,使心肌β-腎上腺素能受體失耦聯(lián)等參與心力衰竭的進(jìn)展[9]。NF-κ B是一種分布和作用十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。多種炎癥因子受到NF-κ B調(diào)控,包括TNF-α、IL-1、IL-2、一氧化氮合成酶（NOS）、IL-6等。在多數(shù)細(xì)胞中,NF-κ B與其抑制蛋白結(jié)合,當(dāng)受到活化刺激后,NF-κ B解離進(jìn)入細(xì)胞核,與多種炎癥因子啟動子區(qū)域中κ B序列結(jié)合,參與炎癥介質(zhì)、黏附分子等轉(zhuǎn)錄[10],誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化、應(yīng)激性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等多種細(xì)胞活動。Anlonella等[6]發(fā)現(xiàn)CHF患者的外周血白細(xì)胞中活化的NF-κ B明顯高于健康人群。急性冠狀動脈綜合征患者PBMCs NF-к B活性顯著高于穩(wěn)定型冠心病和無心血管病的健康對照組[11]。既往研究也證實NF-к B p65在CHF患者的PBMCs中的表達(dá)較正常人明顯增加[12]。

PBMC是CHF時炎性細(xì)胞因子的重要來源[13]。細(xì)菌LPS是人PBM Cs分泌細(xì)胞因子強大的誘導(dǎo)劑[14],CHF患者血漿LPS水平明顯升高,故研究PBMCs分泌細(xì)胞因子水平,對反映CHF患者血液循環(huán)內(nèi)炎癥情況有重要意義。細(xì)胞核上表達(dá)NF-κ B的細(xì)胞數(shù)可作為判斷NF-κ B活化標(biāo)志[15]。本研究結(jié)果顯示,CHF患者PBMCs NF-κ B陽性細(xì)胞率顯著高于無心血管病史的健康體檢者,提示NF-κ B的激活可能是心力衰竭的病理生理特征,可能與心力衰竭進(jìn)程有關(guān)。IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高,表明心力衰竭患者體內(nèi)存在明顯的炎癥反應(yīng)。相關(guān)分析顯示,NF-κ B陽性細(xì)胞率與IL-1β、IL-6、TNF-α水平呈顯著正相關(guān),說明心力衰竭時PBMCs分泌細(xì)胞因子增加,NF-κ B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是心力衰竭炎癥激活的可能機制,并以此途徑參與心力衰竭的進(jìn)展,提示通過抑制NF-κ B活性、降低細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄可干預(yù)心力衰竭進(jìn)程。

[1]Valen G,Yan ZQ,Hanson GK.Nuclear factor kappa-B and the heart[J].J Mol Cell Cardial,2001,38（2）：307-314.

[2]Cohn JN,Ferrari R,Sharpe N,et al.Cardiac remodelingconcepets and clinical implications：a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling[J].J Am Coll Cardiol,2000,35（3）：569-582.

[3]Haudek SB,Bryant DD,Girroir BP.Differential regulation of myocardia NF-κ B following acute or chronic TNF-αexposure[J].J Mol Cell Cardiol,2001,33（7）：1263-1271.

[4]吳錦暉,張新軍,吳琳娜.NF-κ B在慢性心力衰竭發(fā)病機制中的研究[J].華西醫(yī)學(xué),2007,22（4）：925-926.

[5]Baumgarten G,Knuefermann P,Nozaki N,et al.In vivo expression of proinflammatory mediators in the adult heart after endotoxin adminis-tration：the role of toll-like receptor-4[J].J Infect Dis,2001,183（11）：1617-1624.

[6]Anlonella E,Janko W,Anna C,et al.The activation of the NF-κ B system in chronic heart failure[J].J Am Coll Cardiol,2003,41：157-162.

[7]Matsushita H,Morishita R,Nata T,et al.Hypoxia-induced endothelial apoptosis through nuclear factor-kappa B（NF-kappa B）mediated bcl2suppression：in vivo evidence of the importance of NF-kappaB in endothelial cell regulation[J].Circ Res,2000,86（9）：974-981.

[8]Deswal A,Petersen N J,Feldman A M,et al.Cytokines and cytokine recepetors in advanced heart failure：analysis of the cytokine database from the Vesnarinone Trail（VEST）[J].Circulation,2001,103：2055-2059.

[9]Sasayama S,Matsumori A,Kihara Y.New insights into the pathophysiological role of cytokines in heart failure [J].Cardiovasc Res,1999,42：557-564.

[10]鄭仲謹(jǐn),李磊.核轉(zhuǎn)錄因子-κ B在全身炎癥反應(yīng)綜合征中的作用[J].免疫學(xué)雜志,2001,17（4）：314-317.

[11]裘云仙,戴利成,程震峰,等.急性冠狀動脈綜合征患者外周血單個核細(xì)胞群中NF-κ B細(xì)胞率和血漿sICAM-1水平的臨床意義[J].檢驗醫(yī)學(xué),2004,19（5）：465-466.

[12]劉應(yīng)才,劉東華,潘金生.心力衰竭患者外周血單個核細(xì)胞核因子-κ B/p65的表達(dá)及IL-10的影響[J].中國循環(huán)雜志,2006,21（6）：431-434.

[13]Vredevoe DL,Widawski M,Fonarow GC,et al.Interleukin-6expression and Natural Killer（NK）cell dysfunction and anergy in heart failure[J].Am J Cardil,2004,93（8）： 1007-1011.

[14]Banks J,Polle S,Nair SP,et al.Streptococcus sanguis secretes CD14-bindin proteins that stimulate cytokine synthesis：a clue to the pathogenesis of infective（bacterial）endocarditis？[J].Microb Pathog,2002,32：105-116.

[15]Wilson SJ,Leone BA,Anderson D,et al.Immunohistochemical analysis of the activation of NF-kappa B and expression of associated cytokines and adhesion molecules in human models of allergic inflammation[J].J Pathol，1999,189：265-272.