創(chuàng)傷性腦損傷后大鼠腦創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞早期凋亡的實驗研究1）

段虎斌，郝春艷，郝解賀，范益民，劉躍亭，仝海波，劉瑞媛

在全身各部位創(chuàng)傷中，創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的致死和致殘率居于首位［1］，它是神經(jīng)外科的常見病之一，隨著我國交通、建筑和工礦企業(yè)的快速發(fā)展，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢。TBI的發(fā)生發(fā)展機制至今尚未完全明確，有多種學說［2］。本研究旨在分析TBI后大鼠腦創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞早期凋亡的規(guī)律，進一步探究TBI的發(fā)生發(fā)展機制。為TBI的干預治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 BD FACSCaliburTM全自動多色分析流式細胞儀系統(tǒng)，CellQuestTM獲取數(shù)據(jù)軟件，ModFit LTTM分析數(shù)據(jù)軟件（美國BD公司），ZH－藍星B腦立體定位儀（安徽淮北正華生物儀器設備有限公司），牙科臺式電鉆（寧波醫(yī)療器械廠），碘化丙啶（Propidum lodide，PI，美國Sigma公司）。

1.2 動物分組 實驗選取健康成年雄性Wistar大鼠48只，體重270g～290g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機分為3組，即輕度組、中度組、重度組，每組16只。

1.3 實驗步驟

1.3.1 造模取腦 烏拉坦腹腔注射（1.2mg/kg）麻醉滿意后，將大鼠固定在腦立體定位儀上。用Feeney法按自由落體致傷原理，制成一撞擊裝置（由軍事醫(yī)學科學院儀器廠加工），撞桿頭端直徑4.5mm，高2.5mm，外周導管高為40cm，保持90°垂直，每隔1cm有一氣孔，以防錘下落時導管內(nèi)空氣壓縮阻力的影響。制作TBI模型時沿正中線切開頭皮并剝離骨膜，切口長2cm，暴露右頂骨，牙科臺式電鉆于冠狀縫后1.5mm，中線右旁2.5mm處鉆一直徑為5mm的圓形骨窗，保持硬腦膜完整，將撞桿頭端置骨窗處，擊錘（重20g）沿外周導管分別從10cm、30 cm高處自由落下沖擊撞桿，造成右頂葉輕、中度腦挫傷。另用擊錘（重40g）沿外周導管從25cm高處自由落下沖擊撞桿，造成右頂葉重度腦挫傷，致傷沖擊力分別為0.028N·s、0.048N·s和0.088N·s，硬膜保持完整，骨蠟封閉骨窗，于傷后1h斷頭開顱取腦。

1.3.2 收集細胞 PBS液中剝除硬腦膜、蛛網(wǎng)膜、髓質(zhì)，留取創(chuàng)傷周邊區(qū)皮質(zhì)，剪碎，吸管吹打，濾網(wǎng)過濾，濾液離心2次，1 500/min，5min，倒掉上清，留取管底細胞作為待測細胞，調(diào)整待測細胞的濃度為0.5×105/mL～1×106/mL。

1.3.3 固定染色 1 000r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液，3mL PBS洗滌1次，離心去PBS，70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜。離心棄去固定液，3mL PBS重懸5min，400目的篩網(wǎng)過濾1次，1 000r/min離心5min，棄去PBS，用1mL碘化丙啶（PI）染液染色，4℃避光30min。

1.3.4 流式細胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測 CellQuestTM軟件獲取數(shù)據(jù)，Modifit軟件分析凋亡率、DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。

1.3.5 結(jié)果判斷 在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。

2 結(jié) 果

PI單染色法檢測凋亡細胞DNA亞二倍體含量分析結(jié)果顯示，輕度組、中度組和重度TBI組的創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞亞二倍體比 率分別為（8.98±1.29）%、（16.13±1.28）%和（20.11±1.40）%，三組亞二倍體比率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），且損傷程度越重亞二倍體比率越高，即早期凋亡現(xiàn)象越嚴重。

3 討 論

TBI的發(fā)生發(fā)展機制尚未完全明確，有許多學說，如血腦屏障學說、鈣超載學說、自由基學說、腦微循環(huán)學說、能量代謝學說［3－7］等，TBI的原發(fā)性腦損傷包括腦震蕩、腦挫裂傷和原發(fā)性腦干損傷，損傷的病理學改變形式有腦細胞的變性壞死和凋亡，二者可引起繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)功能障礙。

細胞凋亡（Apoptosis），又稱程序性細胞死亡（programmeddeach，PCD），是細胞在體內(nèi)外多種因素刺激誘導下，啟動了死亡程序，并有多種基因調(diào)控的主動死亡過程［8］。細胞凋亡的檢測方法較多，包括光鏡與電鏡的形態(tài)學觀察、瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA梯形條帶法、TUNEL法等［9］。

目前對TBI的細胞凋亡分子生物學研究已深入到基因水平，基因改變在腦損傷后皮層細胞凋亡機制及神經(jīng)修復中有重要意義。皮質(zhì)直接打擊傷（cortical impact injury，CII）可改變cfos、c－jun等即刻早期基因（IEGs）的表達，c－fos基因是促細胞凋亡基因，原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)傷側(cè)大腦皮層c－fos mRNA表達增加，峰值在傷后1h，1d后正常［10］。本實驗采用流式細胞儀PI染色法檢測創(chuàng)傷區(qū)腦細胞亞二倍體核形峰的特征。其原理主要是根據(jù)細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性改變。已有實驗證明凋亡細胞在固定和清洗時，降解的小分子DNA外漏，導致細胞內(nèi)DNA含量減少，因此，應用特異熒光染料PI染色后，在FCM進行的細胞周期分析中，凋亡細胞常常以亞二倍體形式出現(xiàn)，該亞二倍體細胞群被稱為亞G1期（sub－G1）細胞，它的出現(xiàn)被認為是細胞凋亡的重要標志［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)腦損傷細胞早期凋亡存在規(guī)律性，即損傷程度愈重，創(chuàng)傷區(qū)皮層細胞亞二倍體比率越高，即早期凋亡現(xiàn)象越明顯，這與臨床上重型顱腦損傷患者表現(xiàn)出來的腦神經(jīng)功能障礙也最嚴重相一致。

［1］ 王忠誠.王忠誠神經(jīng)外科學［M］.武漢：湖北科學技術出版社，2005：365－366.

［2］ Johanson C，Stopa E，Baird A，et al.Traumatic brain injury and recovery mechanisms：Peptide modulation of periventricular neurogenic regions by the choroid plexus－CSF nexus［J］.J Neural Transm，2011，118（1）：115－133.

［3］ Alres OL，Doyle AJ，Clausen T，et al.Evaluation of topiramate neuroprotective effect in severe TBI using microdialysis［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，993：25－34.

［4］ Sun，David A，Laxmikant S，et al.Traumatic brain injury causes a long－lasting calcium（Ca2＋）－plateau of elevated intracellular Ca levels and altered Ca2＋homeostatic mechanisms in hippocampal neurons surviving brain injury［J］.Eur J Neuroscience，2008，27（7）：1659－1672.

［5］ Tyurn VA，Tyurina YY，Borisendo GG，et al.Oxidative stress following traumatic brain injury in rats：Quantitation of biomarkers and detection off free radical intermediates［J］.Neurochemistry，2000，75（5）：2178－2189.

［6］ Su DS，Wang XR，Zheng YJ，et al.Retrograde cerebral perfusion of oxygenated，compacted red blood cells attenuates brain damage after hypothermia circulation arrest of rat［J］.Acta Anaesthesiologica Scandinavica，2005，49（8）：1172－1181.

［7］ Silva－Adaya D，Perez－De La，Cruz R，et al.Excitotoxic damage，disrupted energy metabolism，and oxidative stress in the rat brain：Antioxidant and neuroprotective effects of L－carnitine［J］.J Neurochemistry，2008，105（3）：677－689.

［8］ Cao G，Pei W，Ge H，et al.In vivo delivery of a Bcl－xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis［J］.J Neurosci，2002，22：5423－2531.

［9］ Valles A，Marti O，Armario A.Mapping the areas sensitive to longterm endotoxin tolerance in the rat brain：A c－fos mRNA study［J］.J Neurochem，2005，3（5）：1177－1188.

［10］ Zhen Y，Li Q，Oishi T，et al.Technical methods for light and electron microscopic observation of sorted cells by FCM：P－12［J］.Human Cell，2008，21（1）：A20.

［11］ Dong XQ，Yu WH，Hu YY，et al.Oxymatrine reduces neuronal cell apoptosis by inhibiting Toll－like receptor 4/nuclear factor kappa－B－dependent inflammatory responses in traumatic rat brain injury［J］.Inflamm Res，2011，60（6）：533－539.