影響血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗結(jié)果的常見因素及相應(yīng)對策

賀智英

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西延安 716000

醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜作支持物的一種區(qū)帶電泳技術(shù)，因其有快速省時、分辨能力強、操作簡單、成本低廉、透明后利于掃描定量及長期保持等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析檢測，已成為醫(yī)學(xué)和臨床檢驗的常規(guī)技術(shù)，血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗也成為了生物化學(xué)實驗課程必開的基礎(chǔ)實驗項目之一。但該實驗影響因素很多，每個環(huán)節(jié)的失誤都會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響而得不到理想的圖譜，并且還造成很大浪費。筆者結(jié)合多年的實驗教學(xué)經(jīng)驗對影響本實驗結(jié)果的常見因素進行分析探討，并提出了相應(yīng)的解決對策?，F(xiàn)報道如下：

1 電泳前準備的影響因素

1.1 醋酸纖維薄膜的因素

1.1.1 醋酸纖維薄膜的選擇 醋酸纖維薄膜如果厚度不一、粗面細孔不均、脆性不一，在電泳時會出現(xiàn)區(qū)帶不均勻、白色斑點處蛋白質(zhì)不泳動而影響圖譜的效果[1]。對策：①購買知名度相對高的正規(guī)廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品；②將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，如漂浮20 s左右時，膜片出現(xiàn)白斑點或條紋，應(yīng)舍去不用[2]。

1.1.2 醋酸纖維薄膜的浸泡 由于醋酸纖維薄膜親水性比較低，浸泡時間過短，不能保證膜片上有一定量的緩沖液，難以使其恢復(fù)原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，所以浸泡時間不少于30 min。浸泡時用鑷子將纖維薄膜條粗面向下平穩(wěn)放入緩沖液中，使其自然濕潤沉下液面或用手輕搖裝液外盒，不要用鑷子、玻棒等器材按壓纖維素薄膜沉下液面，也不要同時將多條纖維素薄膜一起放進緩沖液盒。

1.2 標本的因素

1.2.1 血清標本的新鮮度 不新鮮血清標本蛋白質(zhì)電泳圖譜α2與β之間可能會多出現(xiàn)一條粗而染色均勻的區(qū)帶，也可能會出現(xiàn)電泳圖譜區(qū)帶不清晰，比較離散，甚至有拖尾現(xiàn)象[1]。有研究證明，在2～8℃冰箱保存血清標本，第1天與第2天標本中各蛋白質(zhì)組分百分比變化無統(tǒng)計學(xué)意義，從第3天開始，標本中白蛋白百分比下降，α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白百分比上升均有統(tǒng)計學(xué)意義[3]。因此，必須使用新鮮的血清，如新采取血清標本不是馬上用，則必須放4℃冰箱貯存保鮮，但時間最多不能超過48 h。

1.2.2 溶血標本 溶血標本中白蛋白降低，α2-球蛋白、β-球蛋白升高。嚴重溶血時可見α2、β球蛋白區(qū)帶重疊，區(qū)帶百分比增加[4]，因此應(yīng)采用清亮無溶血的血清標本。

1.2.3 點樣標本的替代 有文獻報道，在實驗教學(xué)中用雞蛋白（雞蛋清∶緩沖液=1∶9）代替血清作為點樣樣品，加樣量約 3 μl，可取得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4條電泳區(qū)帶[5]。用雞蛋白作為實驗材料，既取材方便，又能節(jié)約成本。

1.3 緩沖液的因素

1.3.1 緩沖液的離子強度及pH值 緩沖液的離子強度應(yīng)為0.06，pH應(yīng)為8.6。如離子強度過低緩沖容量小，不易維持緩沖液的pH值恒定，同時導(dǎo)致樣品所載電流增加，電泳速度加快，帶電顆粒在介質(zhì)上擴散嚴重，分辨力明顯降低，區(qū)帶展開延長，導(dǎo)致區(qū)帶拖尾[6]。pH過高、過低也會影響實驗結(jié)果。研究證實，隨著電泳次數(shù)的增加，巴比妥緩沖液的pH發(fā)生變化，且陽極變化明顯，導(dǎo)致電流強度、蛋白遷移率、蛋向區(qū)帶均變小，故巴比妥緩沖液實驗6次左右就應(yīng)更換，否則會發(fā)生明顯拖尾現(xiàn)象[7]。對策：①選擇沒有失效的分析純藥品；②用電子天平準確稱取藥品，精確到0.001 g；③配好后用pH計校正；④學(xué)生多次使用時，應(yīng)在每次電泳前將正負兩極的緩沖液混勻再分別加入電泳槽兩極，保證緩沖液pH值穩(wěn)定或重新配置新的緩沖液。

1.3.2 緩沖液的替代 巴比妥緩沖液中巴比妥有毒性，長期接觸會對人體產(chǎn)生傷害，且實驗教學(xué)中大量使用費用較貴。有實驗證明，用硼酸緩沖液（離子強度：0.08；pH 8.6）代替巴比妥緩沖液能得到更清晰、更理想的電泳圖譜[8-9]。硼酸緩沖液連續(xù)電泳實驗10次蛋白仍可分離清晰，這樣既減少了避免了巴比妥對操作者的傷害，又減少了成本。

1.4 點樣的因素

點樣是本實驗關(guān)鍵的一步，點樣前薄膜的準備、點樣器的選擇、點樣位置的選擇、點樣的量的多少都直接影響最后圖譜的效果。

1.4.1 點樣前薄膜的準備 浸泡好的薄膜吸得過干，電泳時電流不易通過薄膜，樣品在薄膜上流動困難，易導(dǎo)致電泳圖譜有條痕；亦不能留存過多的緩沖液，以避免點樣時血清隨著緩沖液而擴散開來，導(dǎo)致電泳圖譜分離不齊[10]。因此只要用濾紙輕輕吸取薄膜上的多余水分即可。

1.4.2 點樣器的選擇 傳統(tǒng)用載玻片端面點樣，因其寬度稍大于薄膜寬度，點樣血清會橫跨薄膜，產(chǎn)生明顯的邊緣效應(yīng)，且有拖尾現(xiàn)象。有文獻報道，用自制點樣器（將寬為1.3 cm的訂書針折成0.4 cm寬，拋光，再將兩頭插入小塊有機玻璃作為手柄）得到的電泳圖譜中蛋白質(zhì)條帶無邊緣效應(yīng)，也無明顯拖尾現(xiàn)象[11]，并且可以在同一張薄膜上點樣兩次，在實驗教學(xué)中可增加學(xué)生的訓(xùn)練次數(shù)。

1.4.3 點樣位置的選擇 點樣太靠薄膜邊緣，易產(chǎn)生邊流現(xiàn)象；點在薄膜光澤面上，則血清不能滲入薄膜，圖譜不清晰。所以應(yīng)點在無光澤面距邊緣1.5～2.0 cm處，點樣線與薄膜短邊平行。

1.4.4 點樣的量 點樣的量太多易導(dǎo)致電泳圖譜分離不良或產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象；點樣的量太少會使圖譜區(qū)帶顯色過淺。加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)，如電泳后要用洗脫法定量時，每厘米加樣線上加樣量為 0.1～0.5 μl，相當于 5～1000 μg；如是血清蛋白常規(guī)電泳分離時，加樣量不超過每厘米 1 μl，相當于 60～80 μg。對策：對每一種樣品的加樣量應(yīng)先做預(yù)實驗；點樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點樣技術(shù)后，再以印章法使點樣后的樣品呈一條線涂于纖維薄膜[12]。

2 電泳時的影響因素

2.1 搭橋

根據(jù)電泳槽裁剪大小合適的濾紙或脫脂紗布，使其對折后一端的長邊能浸入緩沖液中，另一端的長邊與支架前沿對齊。待濾紙完全浸透后，用玻璃棒輕輕擠壓膜支架上的濾紙或紗布以驅(qū)趕氣泡，使其緊貼在膜支架上[13]。

2.2 平衡

薄膜傾斜放置，電泳圖譜會出現(xiàn)要靠近陽極越窄。薄膜搭在濾紙橋時應(yīng)將無光澤面向下，點樣端放在負極，加樣線距離橋墊2 mm左右；膜條要緊貼濾紙橋不能有氣泡；膜條要拉直，不能下垂。蓋上電泳槽蓋平衡10～15 min。

2.3 通電

2.3.1 通電電壓電流 電壓過高，圖譜展開短，蛋白質(zhì)各組分之間出現(xiàn)擠壓，區(qū)分困難；反之，以低電壓進行電泳時，樣品泳動速度慢且易擴散，所呈現(xiàn)的圖譜常有“拖尾”現(xiàn)象。總電流要根據(jù)放入膜條的多少計算后調(diào)節(jié)，如果太大會將膜條燒斷[6]。按電場強度10～12 V/em（指薄膜與濾紙橋總長度），電流強度0.5～0.8 mA/em膜寬（指薄膜數(shù)目的總寬度）進行計算，并以控制電流大小為主效果較好[14]。

2.3.2 通電時間 電泳時間的長短跟室溫是密切相關(guān)的，具體可待電泳區(qū)帶展開3.5～4.0 cm后關(guān)閉電源。

3 電泳后的影響因素

3.1 染色

染色時間過長，薄膜底色難以脫掉，時間過短，區(qū)帶不易區(qū)分；多條薄膜放入染液時重疊易致染色不良。因此薄膜應(yīng)一條一條逐次放入染液，保證前一條薄膜染色固定后再放入下一條，并輕輕搖動染色杯，染色10 min即可。

3.2 漂洗

漂洗液成分主要為乙醇，易發(fā)揮，所以應(yīng)密封保存或在臨用前配制。為節(jié)省洗液，用鑷子將薄膜從染液中取出時盡量瀝去染液。另外，溫度對薄膜漂洗結(jié)果也有影響，如室溫過低，可將漂洗杯放入恒溫水浴箱，不能超過25℃，能提高漂洗效率，又不影響實驗結(jié)果[15-16]。因此，只需準備3杯漂洗液，將薄膜依次放入3份洗液中，每次5 min即可達到漂洗的目的。

綜上所述，影響血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗的因素很多，在實際操作過程中想要得到理想的圖譜而又不造成浪費和污染，就必須選擇最佳的操作條件和操作方法，盡量避免和減少上述影響因素的影響，以達到臨床檢驗和教學(xué)實驗的目的。

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