動物組織中沙丁胺醇醇殘留檢測的樣品前處理方法研究進展

王國民，李應國，郗存顯，張進忠，李正國

(1.重慶大學生物工程學院，重慶400044;2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶市進出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶400020;3.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400716)

動物組織中沙丁胺醇醇殘留檢測的樣品前處理方法研究進展

王國民1，2，李應國1，2，郗存顯2，張進忠3，李正國1，*

(1.重慶大學生物工程學院，重慶400044;2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶市進出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶400020;3.西南大學資源環(huán)境學院，重慶400716)

綜述了動物組織中沙丁胺醇殘留檢測的樣品前處理方法，包括樣品的水解、提取、凈化和衍生化。免疫親和柱具有很高的選擇性和特異性，特別適用于復雜樣品基質(zhì)中痕量組分的凈化，在沙丁胺醇殘留分析中具有很好的應用前景。

動物組織，沙丁胺醇，殘留檢測，樣品前處理

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)又名舒喘靈，能選擇性激動支氣管平滑肌的β2－受體，臨床上常用于治療支氣管哮喘、哮喘性支氣管炎和肺氣腫患者的支氣管痙攣等呼吸系統(tǒng)疾?。?］。實驗證實:與克倫特羅類似，SAL也能顯著促進動物生長、增加飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率，且在動物體內(nèi)的消除時間比克倫特羅短，毒性較弱，檢測研究相對滯后，已經(jīng)成為克倫特羅的主要替代品［2］。當SAL的添加量超過正常治療劑量時，將造成其在動物體內(nèi)殘留，再通過食物鏈進入人體，進而危害人體健康。目前，SAL殘留的主要檢測方法有:免疫分析法、毛細管電泳法(CE)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(GC－MS/MS)和液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法(LC－MS/MS)等。在復雜基質(zhì)中對低濃度組分進行定性和定量分析，通常需要樣品制備、純化富集、分離檢測和綜合分析等步驟。在這些步驟中，樣品制備和純化富集(即樣品前處理)是殘留檢測的基礎(chǔ)，決定了檢測結(jié)果的準確度和精密度。樣品前處理主要包括提取、凈化、濃縮和衍生化等環(huán)節(jié)。本文就近年來動物源組織中SAL殘留分析的樣品前處理技術(shù)作一綜述，以期為樣品制備提供參考。

1 樣品的提取

在動物的不同組織中，SAL殘留量往往存在很大差異。一般而言，殘留量最高的是視網(wǎng)膜組織，可能是因動物的眼角膜含有豐富的視紫紅質(zhì)，而視紫紅質(zhì)對SAL具有較高的親和力，造成SAL易在眼角膜蓄積［3］。其次是毛發(fā)、肺、肝、腎、肌肉、尿樣和血液等。由于SAL屬于苯酚型β2－激動劑，在動物組織和排泄物中主要以硫酸軛合物和葡萄糖醛酸軛合物的形式存在［4］。因此，在樣品提取中首先要進行水解。

1.1 樣品水解

常用的水解方法有酸水解、堿水解和酶水解三種方式。

1.1.1 酸水解 通常使用高氯酸、鹽酸或三氯乙酸等無機酸。李偉紅［5］等采用HPLC法測定畜禽肉中的SAL殘留時，采用了0.1mol/L高氯酸;王玉飛等［6］測定動物組織中的SAL時，發(fā)現(xiàn)用0.1mol/L高氯酸提取樣品后的提取液基本上呈中性，用0.2mol/L高氯酸提取后溶液的pH為3～4，能提高提取效率。Bocca［7］、顏流水等［8］采用0.1mol/L鹽酸進行水解。吳永寧等［9］在用高效液相色譜－線性離子阱質(zhì)譜法測定畜禽肌肉中SAL等β2－受體激動劑殘留時，采用三氯乙酸水解，樣品提取液的pH在3.6～4.0。

1.1.2 堿水解 通常用NaOH或堿性緩沖液。張雪曼等［10］在測定動物尿液中克倫特羅和SAL時，先用0.50mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)尿液的pH為9.5左右，再進行提取。Lau等［11］在測定牛眼中SAL、克倫特羅時，采用堿性緩沖液進行水解。

1.1.3 酶水解 經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、β－葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶或β－葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，在pH 5.2的緩沖溶液中根據(jù)不同溫度水解反應2～18h。孫雷等［12］在測定動物源性食品中SAL、特布他林、西馬特羅、非諾特羅、氯丙那林、萊克多巴胺、克侖特羅、妥布特羅和噴布特羅等9種β－受體激動劑殘留時，使用β－鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在0.2mol/L乙酸銨緩沖液中37℃避光水浴中水解16h。吉彩霓等［13］在同時測定豬肉中克倫特羅和SAL殘留時，使用β－葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶溶液，在2mol/L乙酸銨緩沖液中37℃水解18h。王煉等［14］用高效液相色譜法測定動物性食品中SAL、奧西那林等4種β2－興奮劑時，使用HP－2型Helix pomatia(酶)，在乙酸銨緩沖液中55℃水解2h。孟娟等［15］同時測定動物組織樣品中的SAL、克倫特羅、特布它林等8種β－興奮劑殘留時，使用β－葡萄糖醛苷酶，在乙酸鈉緩沖溶液中(50±2)℃水解2h。蔡勤仁等［16］測定豬肉中克倫特羅、萊克多巴胺、SAL、利托君、特布他林、班布特羅和異舒普林等7種β－興奮劑殘留時，使用β－葡萄糖苷酸酶溶液，在2mol/L乙酸鈉緩沖溶液中、37℃下水浴水解16h。Cooper等［17］在測定肝臟中SAL時，使用XIV蛋白酶，在磷酸鹽緩沖液或鈣－Tris緩沖液(pH7.4)、60℃水解2h。Boyd等［18］優(yōu)化了牛肝中SAL等β2－興奮劑測定時的酶水解條件，即不同溫度、不同水解時間條件下的酶用量，采用的酶品種為β－鹽酸葡萄糖醛苷酶－芳基硫酸酯酶，酶的用量分別為500～2500單位，37℃，2～16h，實驗選出最佳的酶用量為1000單位，酶解時間從2h增加至16h，所測試得到的沙丁胺醇含量有所增加，但增幅很小。

酸水解和堿水解的優(yōu)點是:簡便、快速、成本低廉，并能減少酶水解中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)對目標化合物的干擾，如張雪曼［10］在測定動物尿液中的克倫特羅和SAL時，在pH 5.0的乙酸鈉緩沖液中加入適量的葡萄糖醛酸酐酶，發(fā)現(xiàn)酶解法較堿水解法獲得的質(zhì)譜圖雜質(zhì)峰多，且在SAL的譜峰附近有干擾峰，影響定量。酸水解和堿水解的缺點是:水解反應較劇烈，可能會造成某些目標物的分解。酶水解的優(yōu)點是:條件比較溫和，不會引起目標物的分解，且重現(xiàn)性好。缺點是:使用成本較高，反應時間較長，且酶水解中酶制劑和其樣品水解后產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)對目標化合物可能產(chǎn)生干擾。從文獻報道來看，使用酶水解的較多，堿水解的相對較少。

1.2 提取方法

動物組織中SAL殘留檢測的提取方法主要有振蕩法、勻漿提取法和超聲波提取法等。

1.2.1 振蕩法 振蕩法是目前較為常用的一種提取方法，樣品經(jīng)打漿或粉碎后，加入適當溶劑，用振蕩器振蕩提取一段時間后離心或過濾，殘渣再用提取溶劑提取或洗滌數(shù)次，再進行濃縮凈化。該法原理簡單，但操作過程較繁瑣。吉彩霓［13］、孫雷等［12］在測定克倫特羅和SAL殘留時采用了該提取方法。

1.2.2 勻漿提取法 勻漿提取法是目前最常用的提取方法，組織樣品經(jīng)粉碎后，加入適當溶劑，用均質(zhì)器高速勻漿提取，然后離心或過濾、濃縮凈化。該法操作相對簡單、耗時少、提取效果好。王煉等［14］用勻漿法提取動物性食品中SAL、奧西那林等4種β2－興奮劑。

1.2.3 超聲波提取法 超聲波提取法是利用超聲波具有的機械效應、空化效應及熱效應，通過增大介質(zhì)分子的運動速度，增強介質(zhì)的穿透力以提取動物組織中殘留物的方法。超聲波使溶劑對細胞壁滲透力更大，強化細胞內(nèi)外的質(zhì)量傳輸;同時破壞細胞壁，使細胞內(nèi)含物更易釋放。超聲波空化可以產(chǎn)生微沖流，能有效打破邊界層，使擴散速度加快，從而使萃取或浸出速度提高2～10倍［19］。吳平谷等［20］采用超聲波提取動物組織中殘留的10種β2－興奮劑，再用氣相色譜－質(zhì)譜法進行測定。

在進行動物組織中SAL的殘留檢測時，很多報道都同時采用了勻漿和超聲提取方法。勻漿將組織粉碎，用超聲波提高提取效率，如王玉飛［6］、金雁等［21］的研究。

2 凈化

由于動物組織樣品組成復雜，通常情況下需要經(jīng)過凈化才能檢測。動物組織中SAL殘留檢測的凈化方法主要有液－液萃取、固相萃取、超臨界流體萃取和基質(zhì)固相分散等。

2.1 液－液萃取法

液－液萃取法是利用樣品中不同組分在兩種不混溶的溶劑中溶解度或分配比的不同來達到分離提取的目的。在堿性條件下，SAL等β－受體激動劑易溶于有機溶劑，通常將水解后的溶液調(diào)節(jié)至堿性后再進行提取，提取溶劑有乙腈、乙醚、乙醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯－異丙醇、乙酸乙酯－丁醇等。蔡勤仁等［16］采用液－液萃取法進行凈化，測定了動物性食品中的SAL、克倫特羅等多種β－興奮劑。蔡欣欣等［22］用液－液萃取凈化，測定了動物源食品中的6種β－受體興奮劑，測試液中的強極性、弱極性雜質(zhì)通過六通閥柱后切換至廢液而不進入質(zhì)譜儀。

2.2 固相萃取(SPE)法

SPE法是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫達到分離和富集目標化合物的目的。SPE可以單獨作為提取、凈化步驟，也可以聯(lián)合液相提取或免疫親和色譜使用。按其作用機制不同，SPE可以分為吸附型固相提取、非極性固相提取、離子交換型固相提取和混合相固相提取。王玉飛等［6］測定動物組織中的SAL時，采用了混合鍵合相硅膠柱MCX柱凈化。王煉等［14］將C18柱和SCX柱串聯(lián)使用，實現(xiàn)了動物性食品中SAL、奧西那林等4種β2－興奮劑的提取凈化。吳平谷等［19］用SLS陽離子交換柱進行凈化，測定了動物組織中的10種β2－興奮劑。金雁等［21］采用C18非極性SPE柱進行凈化，測定了動物組織中的 SAL。Collins等［23］采用XtrackT混合相SPE柱進行凈化，測定了尿液和肝臟樣品中的 SAL和克倫特羅等 β－興奮劑。吳平谷等［24］采用具有反相和陽離子交換作用的SLW混合型SPE柱提取凈化，檢測了動物肌肉中的26種β2－興奮劑和激素。

2.3 超臨界流體萃取(Supercritical fluid extraction，SFE)法

SFE技術(shù)是以超臨界狀態(tài)下的流體為溶劑，利用該狀態(tài)下流體具有的高滲透能力和高溶解能力分離混合物的過程。超臨界流體是溫度與壓力均在其臨界點之上的流體，性質(zhì)介于氣體和液體之間，有與液體相接近的密度，與氣體相接近的粘度和高的擴散系數(shù)，具有很強的溶解能力和良好的流動、傳遞、滲透性能，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有毒、易燃、易揮發(fā)的有機溶劑。最常用的超臨界流體CO2，具有臨界溫度低、對大部分物質(zhì)呈化學惰性、無溶解污染等優(yōu)點，特別適用于熱敏性、易揮發(fā)、易氧化成分的分離萃取。O’Keeffe等［25］使用SFE技術(shù)成功提取了牛肝中ppb級的克倫特羅和SAL殘留。

2.4 基質(zhì)固相分散(Matrix solid－phase dispersion，MSPD)

MSPD是最近發(fā)展的一種選擇性提取凈化技術(shù)。其基本操作是將樣品(固態(tài)或液態(tài))直接與適量反相鍵合硅膠混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒的表面，制成半固態(tài)裝柱，然后按SPE的操作進行洗脫。所用的填充料一般為C18或C8固定相。吸附劑與樣品的用量比例會影響提取、凈化的效果，吸附劑太少，不足以使樣品基質(zhì)完全分散，不利于待測物從基質(zhì)中分離、洗脫，回收率低;吸附劑太多，洗脫液用量大，成本增加，而且洗脫雜質(zhì)增多。因此，樣品和填充料的比例一般為1∶4。Boyd等［18］采用MSPD法提取、凈化牛肝組織中的SAL。洪振濤等［26］用MSPD代替SPE，簡化樣品前處理步驟，將樣品與石墨化碳黑、C18固定相混合、研磨至看不到顆粒狀樣品組織后裝柱，按SPE極性淋洗和洗脫。C18固定相對生物樣品基質(zhì)吸附強，但對鹽酸克倫特羅和SAL保留弱，有利于提取和凈化;石墨化碳黑能有效吸附脂肪酸、甾醇、維生素和色素等雜質(zhì)。

2.5 免疫親和色譜(Immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC是以抗原抗體的特異性、可逆性免疫結(jié)合反應為原理的色譜技術(shù)。當含有待測物的樣品通過IAC柱時，選擇性地結(jié)合待測物，經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)后將抗原－抗體復合物解離，待測物被洗脫，樣品得到凈化。Cooper等［17］采用克侖特羅和SAL兩種結(jié)合抗原與綿羊產(chǎn)生抗血清后制備免疫吸附劑，從柱容量、回收率等方面評價了制備的 IAC柱的性能。Kunakar［27］將免疫球蛋白IgG交聯(lián)上含75%抗SAL和25%抗克倫特羅的抗體，制備免疫親和柱特異吸附組織中的痕量SAL和克倫特羅。Degroodt等［28］用免疫親和柱凈化測定了肝臟中的SAL。王建平等［29］制備了抗SAL的抗血清，提取、純化IgG制備免疫親和色譜柱，測定了肝臟中的SAL和克倫特羅。

2.6 分子印跡技術(shù)(Molecularly imprinting technology，MIT)

MIT是指制備對某一特定分子(模板分子或印跡分子)具有選擇性的聚合物，即分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer，MIP)的過程。將模板分子(印跡分子，待分離、識別的分子)同具有適合官能團的功能單體形成單體－印跡分子復合物，在交聯(lián)劑和引發(fā)劑的作用下，形成具有大孔、網(wǎng)狀的聚合物，通過溶劑洗脫或在一定條件下水解、除去印跡分子，聚合物中就留下了空間大小、形狀及功能基團與印跡分子匹配的“記憶”空穴，這樣的空穴便可以與混合物中待分離的印跡分子進行特異性的結(jié)合，即對印跡分子具有專一性識別作用。Kootstrat等［30］采用MIT凈化技術(shù)測定牛肉中西馬特羅、萊克多巴胺等8種β－受體激動劑，實驗表明該凈化技術(shù)能夠滿足定量測定的要求，并且能夠用于兔肉、鴨肉、火雞肉、肝臟和各種魚類樣品的凈化。Widstrand等［31］對MI SPE凈化測定牛尿中鹽酸克倫特羅、妥洛特羅、萊克多巴胺等6種β－受體激動劑進行了評價，認為選擇合適的模板分子是制備 MIP的關(guān)鍵因素。Van等［32］使用MIP凈化技術(shù)測定尿中沙丁胺醇等多種β－受體激動劑，并考察了MIP凈化HPLC－MS/MS測定的基質(zhì)效應，結(jié)果表明，MIP凈化的選擇性好，對沙丁胺醇的測定無抑制。

液－液萃取法需要的儀器設(shè)備簡單，成本相對較低，但受pH影響大，溶劑用量較大，且有機溶劑對人和環(huán)境有負面影響。SPE采用高效、高選擇性的吸附劑(固定相)，使用的溶劑量較少，處理過程中不產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可簡化樣品處理步驟，但其成本較液－液萃取高。SFE具有速度快、效率高、選擇性強、幾乎不使用溶劑等優(yōu)點，但需要專門的設(shè)備。MSPD能避免樣品均質(zhì)、轉(zhuǎn)溶過程中造成的目標物損失，固定相處理樣品的比容量大，處理樣品快速，節(jié)省溶劑，樣品用量少，是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ臉悠诽幚砑夹g(shù)。MIT是一種新型高效分離及分子識別技術(shù)，具有優(yōu)越的識別性和選擇性。因分子印跡聚合物的設(shè)計合成受到模板分子性質(zhì)、尺寸，以及功能單體、交聯(lián)劑、溶劑、引發(fā)劑、引發(fā)方式、聚合時間等諸多因素的影響，分子印跡聚合物的合成是一項復雜的研究工作，對其制備方法進行的優(yōu)化也是非常困難的［33］。IAC對待測物具有很高的選擇性和特異性，特別適用于復雜基質(zhì)中痕量組分的分析，20世紀80年代以來迅速發(fā)展為殘留分析檢測中的前處理手段，該技術(shù)結(jié)合免疫反應和SPE的凈化分離，操作簡單、靈敏，凈化和富集效能強。因此，IAC在SAL殘留分析中的研究與應用具有良好的發(fā)展前景，特別是液相色譜法同免疫親和柱的結(jié)合應用將會成為一個重要的發(fā)展方向。

3 衍生化

SAL屬苯酚型β2－興奮劑，分子中含有－OH和－NH2等極性基團，沸點高、難揮發(fā)，不能直接采用GC或GC－MS分析，必須衍生化后才能檢測分析，衍生化反應主要有甲基硼酸和丁基硼酸化、硅烷化兩種方式。

3.1 甲基硼酸和丁基硼酸化

Ramos等［34］研究了GC－MS法測定SAL、克倫特羅和特布他林等多種β2－興奮劑的甲基硼酸和丁基硼酸化條件，確定55℃恒溫60min為衍生化的適宜溫度，衍生化產(chǎn)物在－20℃可穩(wěn)定4d以上。

3.2 硅烷化

在用GC－MS法測定SAL時，硅烷化是應用最廣泛的衍生化方式。衍生化試劑主要有N－甲基－N－三甲基硅基－三氟乙酰胺(MSTFA)、N，O－雙三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)、99%BSTFA－1%三甲基氯硅烷(TMCS)，衍生化溫度和時間隨不同的衍生化試劑和被測物種類略有差異。梁曉聰?shù)龋?5］用BSTFA－1%TMCS衍生化，在(80±5)℃的烘箱中恒溫衍生60min，SAL和克倫特羅的衍生化產(chǎn)物在48h內(nèi)保持穩(wěn)定。王玉飛等［6］用BSTFA衍生化，在75℃衍生45min，測定了動物組織中的特布他林和SAL。孟娟等［15］優(yōu)化了BSTFA+TMCS(99+1)的衍生化條件，確定70℃衍生30min，同時了測定動物性食品中包括 SAL在內(nèi)的 8種 β－興奮劑。朱堅等［36］用BSTFA衍生化，在(65±5)℃衍生(30±5)min，測定了肝、腎和肉中的11種β2－受體激動劑。吳銀良等［37］用BSTFA衍生化，在80℃衍生1h，測定了豬組織中的SAL。

4 展望

目前，動物組織中SAL殘留檢測的樣品前處理技術(shù)處于不斷更新和完善之中，正向著快速、靈敏、準確、高效的方向發(fā)展。IAC的凈化和富集效能強，在復雜基質(zhì)中痕量組分分析領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要的作用，在SAL殘留檢測中將具有良好的應用前景。

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Research progress in pre－treatment method for residual detection of salbutamol in animal tissues

WANG Guo－min1，2，LI Ying－guo1，2，XI Cun－xian2，ZHANG Jin－zhong3，LI Zheng－guo1，*
(1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China;2.Chongqing Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing Import and Export Food Safety Engineering Technology Research Center，Chongqing 400020，China;3.College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China)

This paper reviewed the pre－treatment methods for determination of albutamol，including hydrolysis，extraction，purification and derivatization.Immunoaffinity columns have high selectivity and specificity，especially for complex sample matrix during the purification of trace components，and show a promising prospect on the research and application for residual analysis of salbutamol.

animal tissue;salbutamol;residual detection;sample pre－treatment

TS201.2

A

1002－0306(2011)04－0400－05

2010－02－22 *通訊聯(lián)系人

王國民(1965－)，男，高級工程師，主要從事進出口食品的檢驗檢疫工作。

國家質(zhì)檢總局項目資助(2008IK153)。