DNA分子標(biāo)記在念珠菌遺傳多樣性中的應(yīng)用

熊娟 閻瀾 姜遠(yuǎn)英，

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350108;2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

DNA分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記形式［1］。大致有基于 southern雜交技術(shù)、PCR反應(yīng)、限制性酶切與PCR技術(shù)相結(jié)合和單核苷酸多態(tài)性等DNA分子標(biāo)記［2］。目前，已經(jīng)應(yīng)用的有幾十種DNA分子標(biāo)記，最常見的如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、簡單序列重復(fù)標(biāo)記(Simple Sequence Repeats，SSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs)等［3］，已被廣泛地應(yīng)用于真菌遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及克隆、遺傳多樣性和分離菌株的DNA鑒定等方面的研究。

利用傳統(tǒng)的真菌分類方法常引起分類系統(tǒng)的不穩(wěn)定或分歧，核酸技術(shù)為真菌檢測開辟了一條新的有效途徑，它可用于真菌種的鑒定，更多的是用于亞種、變種水平上的鑒定。條件性致病念珠菌尤其是白念珠菌 (Candida albicans)是醫(yī)院感染常見病原真菌，現(xiàn)已成為艾滋病、腫瘤、移植和吸毒等免疫缺陷患者的死亡原因之一。因此確定念珠菌的感染源和傳播途徑意義重大，這不僅需對念珠菌在種間水平分類，還需深入到種內(nèi)甚至亞種水平。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)可以將不同菌株基因分型，快速、準(zhǔn)確地鑒定出不同菌株，以深入對其流行病學(xué)和耐藥機(jī)制的了解［4-5］，這對醫(yī)院抗菌藥物使用及尋找新的抗真菌藥物具有重要指導(dǎo)作用。

1 RAPD標(biāo)記技術(shù)

1.1 RAPD標(biāo)記技術(shù)原理及其特點

RAPD 標(biāo)記是 Williams等［4，6］于 1990 年建立的基于PCR基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記技術(shù)。它采用人工合成的較短的隨機(jī)排列堿基順序的核酸單鏈(通常為10個核苷酸左右)為引物，在一種熱穩(wěn)定DNA多聚酶的作用下，對所研究的未知序列的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測其多態(tài)性。

實驗中DNA的用量少，減少了大量的提取工作。但其實驗穩(wěn)定性和重復(fù)性差;其次是顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復(fù)雜［7-8］。

1.2 RAPD在念珠菌中的應(yīng)用

白念珠菌的基因型特性對于研究其致病性具有重要意義。RAPD技術(shù)可用于念珠菌的多態(tài)性及其親緣關(guān)系的研究，其條帶可以清楚顯示念珠菌及其相關(guān)酵母菌屬間、種間及種內(nèi)基因組型的差異。孫靜等［9］研究108株白念珠菌臨床分離株，經(jīng)PCR 25S rDNA分析分為3型:A(31株)，B(68株)，C(9株);而RAPD指紋技術(shù)分析產(chǎn)生21種基因型。對比兩種結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR 25S rDNA方法中A組菌株在RAPD技術(shù)分析時又被細(xì)分為11種基因型，B組被分為16種。結(jié)果顯示在對白念珠菌進(jìn)行種內(nèi)分型時，RAPD指紋技術(shù)優(yōu)于PCR 25S rDNA，更能反映出種內(nèi)不同菌株間的差異。Giammanco等［10］的研究也充分證明了這種方法在白念珠菌基因分型方面的有效性。

RAPD與傳統(tǒng)的生物化學(xué)等方法相比，在區(qū)分不同基因型的白念珠菌時具有更高的分辨力。Costa CR等［11］利用RAPD方法研究發(fā)現(xiàn)，在14株遺傳圖譜表現(xiàn)一致的白念珠菌中有4種不同的基因型，說明在白念珠菌中存在高度的遺傳多態(tài)性。此外，他們還觀察到600 bp和450 bp的保守帶型，這對于白念珠菌的鑒定和利用RAPD對白念珠菌流行病學(xué)的研究具有重要意義。

運(yùn)用RAPD方法選擇非特異性引物，通過PCR產(chǎn)生一系列片段作為菌株基因分型的基礎(chǔ)，項明潔、彭奕冰等［12］用相同序列的隨機(jī)引物和相同的優(yōu)化條件，對從醫(yī)院患者中分離的105株菌株進(jìn)行RAPD分析。獲得的RAPD譜型各不相同，其中102株白念珠菌集中分布于5個主要型別中，另3株各成一型。這為目前臨床上白念珠菌的流行提供了資料，并驗證了該方法對白念珠菌基因分型的可行性。

2 AFLP標(biāo)記技術(shù)

2.1 AFLP技術(shù)原理及其特點

AFLP技術(shù)結(jié)合了限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技術(shù)和RAPD技術(shù)，是1993年由荷蘭Keygene公司的Zabean等發(fā)明，它將基因組DNA用成對的限制性內(nèi)切酶雙酶切后產(chǎn)生的片段用接頭連接起來，并通過N端與接頭互補(bǔ)的半特異性引物擴(kuò)增得到大量DNA片段，從而形成指紋圖譜的分子標(biāo)記技術(shù)。因此其具有RAPD的高效性特點，又兼有RFLP的穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)的特點［13］。

但是，目前AFLP是一種受專利保護(hù)的技術(shù)，只能用于非盈利的科學(xué)研究。此外，基因組的不完全酶切會影響實驗結(jié)果，因此對內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高，用于遺傳作圖時，少數(shù)的標(biāo)記與圖譜緊密度有出入。

2.2 AFLP在念珠菌中的應(yīng)用

不同種的念珠菌可同時感染同一機(jī)體，而某一部位感染的菌株盡管其表現(xiàn)的形態(tài)不一致，但基因型卻是一致的，故僅靠表型和血清學(xué)方法對不同致病性念珠菌進(jìn)行鑒別是困難的。Candida orthopsilosis和Candida metapsilosis曾被認(rèn)為是近平滑念珠菌的種內(nèi)變種，運(yùn)用分子系統(tǒng)學(xué)和其遺傳差異分析發(fā)現(xiàn):C.orthopsilosis和C.metapsilosis是單獨的種類［14］。常規(guī)的遺傳和生理生化手段難以達(dá)到菌株水平的區(qū)分，必須借助于DNA分子標(biāo)記方法來完成。Hensgens等［15］用AFLP考察了從臨床中分離出的391株菌株中C.orthopsilosis和C.metapsilosis出現(xiàn)的頻率，C.metapsilosis約占5%(20株)，這一數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了C.metapsilosis在臨床中出現(xiàn)并與機(jī)體感染有關(guān)的報道，并推翻了之前的說法:幾乎不可能從感染人體真菌中分離到一個新的菌種。在AFLP分析中采用4種不同的引物組合，共得到68個不同的帶型，比較菌株的AFLP圖譜可知:在C.metapsilosis中存在著遺傳多樣性。該標(biāo)記不僅增強(qiáng)了檢測技術(shù)的辨別能力，同時可檢測到大量的多態(tài)性片段。

已有研究表明光滑念珠菌遺傳變異性很低，為了更深入研究其染色體組型和表型，Tavanti等［16］從四個不同國家不同類型感染的患者體收集了62株光滑念珠菌，運(yùn)用AFLP來鑒定其種別和種內(nèi)差異性。AFLP結(jié)果表明:收集的62株菌株基本無種的變異，其相似系數(shù)為0.97;AFLP多態(tài)性條帶很少，與 Butler等［17-18］的研究結(jié)果也一致:光滑念珠菌沒有明顯的序列差異。

3 SSR標(biāo)記技術(shù)

3.1 SSR技術(shù)原理及其特點

1991年Mooer等結(jié)合PCR技術(shù)創(chuàng)立了簡單重復(fù)序列標(biāo)記技術(shù)，又稱微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)、短串聯(lián)重復(fù) (Short Tandem Repeat，STR)或簡單重復(fù)序列長度多態(tài)性(Simple sequence length polymorphisms，SSLP)。它是以少數(shù)幾個(一般為1～6 bp)核苷酸為重復(fù)單位的首尾串聯(lián)重復(fù)DNA序列。其標(biāo)記的基本原理是根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。

SSR在原核和真核生物基因組中均有分布［19］，多態(tài)性豐富，微衛(wèi)星檢測方法簡易高效安全，并可以多個位點同時進(jìn)行檢測;但是微衛(wèi)星進(jìn)化具有復(fù)雜性，可能出現(xiàn)同源異型或異源同型;建立和篩選基因文庫，進(jìn)行克隆和測序，都非常繁瑣、耗時;目前還沒有發(fā)現(xiàn)哪個DNA探針能很好地匹配他們各自的多態(tài)性。

3.1 SSR標(biāo)記技術(shù)在念珠菌中的應(yīng)用

在引起血液感染的念珠菌中，光滑念珠菌是較常見的臨床分離菌株之一［20-21］。新微衛(wèi)星位點的鑒定能夠區(qū)分出不同的菌株。Sabino等［22］選擇了4個特異性的標(biāo)記序列對233株光滑念珠菌進(jìn)行了基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性位點出現(xiàn)在20～42個等位基因中和39～92種基因型中，在多樣性分析中發(fā)現(xiàn)了192個基因型。將SSR標(biāo)記和其他幾種分子標(biāo)記如RFLP、ITS等鑒定出的基因型比較發(fā)現(xiàn):SSR區(qū)分菌株之間的差異能力明顯高于其他幾種方法。

SSR標(biāo)記對區(qū)分念珠菌是非常有力的工具，對流行病學(xué)中念珠菌相關(guān)性，醫(yī)院之間交叉感染，及其從繁殖到感染的動力學(xué)研究具有重要作用。Barada等［23］考察了從黎巴嫩的5個醫(yī)院收集的125株念珠菌，采用SSR基因分型方法對其進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn):SSR方法對菌株鑒定結(jié)果錯誤率在2%～33%不等，平均為7%;用SSR方法鑒定出具有相同基因型的菌株在幾個醫(yī)院均有出現(xiàn)，排除了醫(yī)院感染因素的可能性。采用SSR基因分型法，研究還發(fā)現(xiàn)雜合子等位基因異質(zhì)性丟失可導(dǎo)致菌株對唑類藥物的耐受。

4 SNPs標(biāo)記技術(shù)

4.1 SNPs技術(shù)原理及其特點

SNPs主要是指近緣種群或同種個體基因組水平上由于單核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，其多態(tài)性頻率大于1%，常表現(xiàn)為核苷酸的轉(zhuǎn)換、顛換。SNPs分析技術(shù)按其研究對象主要分為兩大類:一是尋找未知的SNPs或確定某一未知SNPs與某種遺傳病的關(guān)系;二是對不同群體的SNPs遺傳多樣性進(jìn)行檢測或在臨床上對已知致病基因的遺傳病進(jìn)行基因診斷。由于SNPs密度高、富有代表性、遺傳穩(wěn)定、易自動化分析等特點使其作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛應(yīng)用。

4.2 SNPs標(biāo)記技術(shù)在念珠菌中的應(yīng)用

白念珠菌是臨床治療中最廣泛的條件致病菌，有廣譜的致病性和很強(qiáng)耐藥性，其重要原因就是基因變異。研究表明白念珠菌具有促進(jìn)基因變異的遺傳機(jī)制，在營養(yǎng)物質(zhì)充分和抗真菌藥物的作用下就可以啟動這些機(jī)制。Forche等［24］采用 SNPRFLP方法來檢測白念珠菌中雜合子缺失 (loss of heterozygosity，LOH)。該方法是基于限制性酶分析的。所選用的SNP-RFLP標(biāo)記均只有唯一的限制性酶切位點。在研究YJB10019菌株和其親本菌SC5314時發(fā)現(xiàn)，chrR、chr1、chr2上的4個標(biāo)記在YJB10019中都是純合子，在SC5314中都是雜合子。表明:在白念珠菌中部分或全部染色體存在雜合子缺失，此結(jié)果與之前Forche的研究結(jié)果［25］也一致。

基因序列顯示白念珠菌SC5314中大約有62 000個SNPs，對于研究其群體遺傳學(xué)和菌株之間的關(guān)系是一巨大資源。Forche等［26］通過建立白念珠菌全基因組SNPs圖譜，研究了有絲分裂重組包括雜合位點基因轉(zhuǎn)變，染色體缺失等在白念珠菌體內(nèi)、外毒力變化中的作用。該圖譜包含131個標(biāo)記共561個SNPs，其平均密度是1/111 bp，標(biāo)記序列全部或部分在編碼區(qū)。白念珠菌耐藥性機(jī)制之一就涉及到在基因ERG11上的LOH。運(yùn)用SNP技術(shù)研究了幾株由親本菌SC5314經(jīng)基因敲除后得到的菌株后發(fā)現(xiàn)，LOH與基因處理如基因敲除，或在選擇性培養(yǎng)基生長沒有直接的關(guān)系，即基因處理不會直接導(dǎo)致LOH的增加。

5 小結(jié)與展望

隨著生物標(biāo)記技術(shù)及分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA分子標(biāo)記技術(shù)也在不斷完善，目前還沒有哪種DNA分子標(biāo)記可以同時滿足所有應(yīng)用的需要。本文所介紹的幾種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，是現(xiàn)階段念珠菌種鑒定和遺傳多樣性研究中使用最廣泛、簡便和有效的技術(shù)。從菌株的鑒別能力方面比較，RAPD、AFLP技術(shù)已能滿足研究和生產(chǎn)的需要。RAPD標(biāo)記的位點多、大量隨機(jī)引物的使用，使RAPD標(biāo)記覆蓋物種的整個基因組，目前被認(rèn)為是最有前途的群體遺傳標(biāo)記。AFLP可在一次試驗中同時檢測到更多的多態(tài)性片段，有助于遺傳差異的更完全綜合和在相似群進(jìn)一步分類，因而將在生物多樣性、微生物鑒定、遺傳等領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)，同時也將是基因表達(dá)和調(diào)控、數(shù)量性狀基因研究的有效工具。SSR對大規(guī)模的流行病學(xué)研究是一個很好的選擇，在區(qū)分臨床菌株、研究醫(yī)院間真菌交叉感染、真菌繁殖到感染的代謝動力學(xué)的研究方面是很重要的工具。SNPs在基因組廣泛而穩(wěn)定地存在，提供了一批很好的分子標(biāo)記，在高密度遺傳圖譜構(gòu)建、基因的精確定位、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面均具有廣闊的應(yīng)用前景。大規(guī)模的SNPs分型需要準(zhǔn)確可靠的檢測方法作為技術(shù)支持，所以在未來的SNPs發(fā)展中，建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠且成本低廉的方法是SNPs分型的發(fā)展方向。

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