胰腺癌血清Periostin水平與淋巴結轉移的關系

劉 宇 劉保安 (中南大學湘雅基礎醫(yī)學院病理學系，湖南 長沙 410078)

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，多發(fā)生于胰頭部。腹痛及無痛性黃疸為胰頭癌的常見癥狀。癌腫轉移在早期即可出現(xiàn)，對于胰腺癌臨床又缺乏早期診斷的有力手段，采用手術切除方式只有10%～15%的病人在確診后可以根治性切除，況且腫瘤患者5年存活率也只有5% ～20%〔1〕。胰腺癌淋巴結轉移對于手術治療和預后是至關重要的因素。近年來發(fā)現(xiàn)，Periostin(PN)的過表達與腫瘤的惡性程度、侵襲性和轉移性有密切關系〔2，3〕。本文將利用ELISA技術探討胰腺癌血清PN水平與淋巴結轉移的相關性。

1 資料與方法

1.1 試劑與設備 人PN重組蛋白、兔抗人PN mAb、兔抗人PN pcAb、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(IgG-HRP)和牛血清白蛋白(BSA)(R＆D 公司)，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(上海江萊生物科技有限公司)。雷勃MK3 Multiskan酶標儀、THERMO Wellwash 4 MK2全自動洗板機(Thermo公司，芬蘭)。

1.2 標本采集 所有受試者均根據(jù)診斷標準進行確診，并分組處理，診斷依據(jù):(1)臨床表現(xiàn)為腹痛、黃疸和消瘦;(2)實驗室檢查:①一般血清生化學檢查;②胰腺癌血清學標記物免疫學檢查:具體包括:糖鏈抗原19-9(CA19-9)，癌胚抗原(CEA)，胰胚抗原(POA)、胰腺癌特異抗原(PaA)及胰腺癌相關抗原(PCAA)檢測指標;③影像學檢查:B超、CT、磁共振成像(MRI)進行胰腺癌普查、篩選、診斷、確診，以供分組。檢查結果其中健康成人31例(自愿健康體檢者)，胰腺癌患者18例和有遠處轉移的胰腺癌患者18例，采集67例受試者的血清樣本，收集血清后，迅速離心10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 ELISA方法

1.3.1 操作 首先采用棋盤滴定法確定最佳濃度，結果表明:在包被抗體濃度1.0 μg/ml，檢測抗體濃度1∶1 000比例時，標準曲線線性關系佳。具體操作:(1)將兔抗人PN mAb稀釋1∶1 000后，包被酶標板，在4℃中，包被48 h，用3%BSA 進行封閉;(2)在37℃溫度下，加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的人PN重組蛋白標準品使其作用1 h;(3)再加入經(jīng)1%PBS稀釋的1∶1 000 PN pcAb，4℃環(huán)境過夜，然后再放置室溫1 h;(4)加入經(jīng)1%PBS稀釋的1∶1 500羊抗兔IgG-HRP，37℃恒溫箱顯色15 ～30 min 后，讀記吸光度 A450 值〔3，4〕。

1.3.2 鑒定檢測與PN檢測分析 先以兔抗人PN mAb包被酶標板，分別加入白介素6(IL-6)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1(VCAM-1)、生長激素(GH)和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)，測定A450值并與陰性對照比較。如果PN測值為0或很低，提示血清中IL-6、VCAM-1、GH和ACTH抗原對PN的檢測影響很小，試劑盒的特異度較強〔4，5〕。PN ELISA 試劑盒分別測定 31例健康成人，18例胰腺癌患者和18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者的血清PN，以PN蛋白濃度為橫座標，以A450平均值為縱座標，繪制標準曲線。標準曲線由分析軟件處理。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗。

2 結果

2.1 標準曲線靈敏度和特異性評價 取3份已知濃度的標準品，進行批內(nèi)和批間變異系數(shù)分析。分析結果顯示:試劑盒的試驗內(nèi)變異系數(shù)平均為7.6%，均小于10%;試驗間變異系數(shù)平均為13.15%，均小于15%。在不同PN濃度的PN蛋白標準液，用已建立的ELISA方法測得的回收率在82% ～92%之間，平均回收率為89.6%。標準曲線方程式曲線擬合度R2=0.968。線 性 范 圍 為 4.903～500 ng/ml。靈 敏 度 為4.903 ng/ml。在加入 IL-6、VCAM-1、GH 和 ACTH 后測 A450值，與陰性對照孔的A450值比較，無顯著性差異，無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示PN蛋白與這些物質(zhì)均無交叉反應，試劑盒的特異度較強。

2.2 檢測結果 健康對照者31例的血清PN含量為(22.0±6.8)ng/ml，分布呈正態(tài)，以血清濃度＜35.60 ng/ml為正常界值。18例胰腺癌患者的血清PN含量為(37.9±20.9)ng/ml，18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者的血清PN含量為(45.6±25.8)ng/ml。胰腺癌患者與健康對照者間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而18例胰腺癌患者與健康對照者和18例有淋巴結轉移的胰腺癌患者之間均有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

PN過表達與惡性腫瘤惡性程度相關，PN與整合素結合并相互作用參與腫瘤發(fā)展，同時通過整合素和(或)EGF信號途徑促進癌細胞侵襲轉移。有研究表明，PN在促進癌細胞生存中起重要作用，并提出了其抗體可能是有效的治療藥物的假設。PN在腫瘤血管生成、轉移瘤生長中起關鍵作用〔6，7〕。

由于腫瘤轉移容易導致抗癌治療失敗和患者死亡〔8〕，而轉移相關基因被認為是早期預測惡性腫瘤生物學行為的關鍵。大量研究發(fā)現(xiàn)，PN基因就是腫瘤轉移候選基因之一，具有促進晚期腫瘤進展的作用;PN蛋白過表達與腫瘤轉移和預后不良具有很好的相關性〔9〕。然而胰腺癌腫瘤誘導PN細胞因子的分子機制尚不明確，PN如何促進癌細胞生長和生存機制也尚需進一步研究?？墒?，本文實驗研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的PN蛋白水平明顯高于健康正常人，而有淋巴結轉移的胰腺癌患者其PN蛋白水平明顯高于胰腺癌患者，這些都證實了PN與腫瘤轉移有密切關系。因此，PN蛋白水平的檢測可以用于判斷胰腺癌和作為診斷胰腺癌是否出現(xiàn)淋巴結轉移的指標。

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