沙門菌載體重組疫苗的研究進(jìn)展

馬延濱,高閃電,叢國(guó)正,?；菔|

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部畜病毒學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730046)

目前,大多數(shù)疫苗都采用皮下或肌肉注射,可以誘導(dǎo)有效的血清免疫,但通常無(wú)法誘導(dǎo)黏膜抗體(sIgA)的產(chǎn)生。皮下或肌肉注射導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生較大的應(yīng)激反應(yīng),采食量下降,影響動(dòng)物生長(zhǎng)繁殖。實(shí)際生產(chǎn)中的不規(guī)范免疫操作可能導(dǎo)致病原微生物在個(gè)體間的人為傳播而引發(fā)疾病。

細(xì)菌和病毒在自然宿主體內(nèi)的傳播,導(dǎo)致多種感染性疾病持續(xù)存在。這種情況甚至危及到公共安全以及瀕危動(dòng)物的生存[1]。在大多數(shù)情況下,通過(guò)屠宰的手段控制病原菌在自然宿主之間的傳播是不經(jīng)濟(jì)的,同時(shí)也不會(huì)被公眾所接受。

針對(duì)皮下或肌肉注射的特點(diǎn),以及野生動(dòng)物免疫現(xiàn)狀?？诜呙绲难兄瞥蔀楫?dāng)前熱點(diǎn)。

口服疫苗是指通過(guò)口服,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)致病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫,從而使機(jī)體獲得保護(hù)或消滅該病原能力的生物制品。

目前,口服疫苗的研制主要是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將目的抗原基因克隆表達(dá)到載體質(zhì)粒上,然后將其轉(zhuǎn)染到特定的載體系統(tǒng)中表達(dá)。一般常用的活載體系統(tǒng)包括細(xì)菌載體、病毒載體、植物載體。這里我們將介紹弱毒沙門菌作為載體制備口服疫苗的研究進(jìn)展。

1 沙門菌載體疫苗的免疫機(jī)制

1.1 重組沙門菌穿越腸壁的機(jī)制 腸上皮層覆蓋有皮爾氏小體(Peyer′s patches,PP),PP表面有特化的上皮M細(xì)胞(membranous epithelial cells)[2]。重組沙門菌可以粘附在M細(xì)胞上,然后M細(xì)胞將沙門菌載體轉(zhuǎn)移到皮爾氏小體中,完成載體疫苗的穿越腸壁過(guò)程[3]。

1.2 沙門菌載體疫苗的免疫過(guò)程 PP的M細(xì)胞下是皮下半球形區(qū)域。這個(gè)區(qū)域有豐富的DCs(樹(shù)突狀細(xì)胞),位于半球形區(qū)之下的是B細(xì)胞囊,它的兩邊被T細(xì)胞填充。當(dāng)重組沙門菌進(jìn)入PP時(shí),首先被半球形區(qū)中的 DCs所捕獲,然后將其呈遞給T細(xì)胞,誘導(dǎo)PP中的T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答或者直接將其呈遞到MLN中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫[4]。

在重組沙門菌登革熱疫苗株SL3261/pLT105的免疫研究中發(fā)現(xiàn),重組疫苗分泌的可溶性目的抗原不能保護(hù)小鼠免受登革熱病毒感染。弱毒沙門菌膜上表達(dá)的抗原決定簇與單純的分泌型抗原相比,菌膜上表達(dá)的抗原決定簇可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答[5]。

2 弱毒沙門菌的研究

沙門菌致弱的根本是使之不能合成芳香族化合物的前體,在哺乳動(dòng)物沙門菌致弱時(shí),應(yīng)用最多的是誘導(dǎo)細(xì)菌苯甲酸對(duì)位氨基的缺失。這些突變株即使對(duì)免疫缺陷型小鼠也不會(huì)致病。但是對(duì)不同類型的沙門菌來(lái)說(shuō),他們的生長(zhǎng)速度基本相同[6]。

T3SS(type three secretion system)對(duì)沙門菌進(jìn)入PP來(lái)說(shuō)是必需的[7]。與沙門菌的侵襲和細(xì)胞內(nèi)生存相關(guān)的功能被位于毒力島的至少60種相關(guān)基因所調(diào)節(jié),其中主要是對(duì)沙門菌T3SSⅠ(type three secretion systemⅠ)和T3SSⅡ(type three secretion systemⅡ)的編碼調(diào)節(jié)。T3SSⅠ存在于基本上所有的沙門菌亞種,并且是非侵襲性沙門菌感染所必需的。T3SSⅡ存在于胞內(nèi)寄生以及致病沙門菌。

S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH09中存在一個(gè)無(wú)效突變。突變前這個(gè)基因編碼T3SSⅡ中的成分,并且是參與合成細(xì)菌生長(zhǎng)必需的一種芳香性物質(zhì)[8]。這種突變型菌株作為口服疫苗已經(jīng)在一個(gè)大的隨機(jī)人群中進(jìn)行了試驗(yàn)。試驗(yàn)表明,這種口服傷寒疫苗不會(huì)引發(fā)機(jī)體的病理表現(xiàn),并且提供比目前所用傷寒疫苗更強(qiáng)的保護(hù)力。因此,S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH 09可以作為一種理想的口服疫苗載體。

3 沙門菌載體重組疫苗的實(shí)驗(yàn)室研究

目前,越來(lái)越多的弱毒沙門菌作為疫苗載體成為實(shí)驗(yàn)室的研究對(duì)象,并且取得了較好的成果。3.1 沙門菌載體重組疫苗在細(xì)菌中的應(yīng)用 Leslie W JBaillie,Marcela F Pasetti等用沙門菌突變株Typhi Ty21a組建了炭疽的重組載體疫苗?？诜庖咝∈蠛?少數(shù)出現(xiàn)對(duì)致死性炭疽孢子較強(qiáng)的特異性應(yīng)答,免疫效果優(yōu)于目前鋁包被炭疽疫苗(AVA)[9];Qianli Ma,Qiao Zhang等構(gòu)建的表達(dá)psaA(肺炎球菌表面粘附素A)和pspA′(肺炎球菌N-端蛋白A)的重組沙門菌疫苗可以誘導(dǎo)表達(dá)高水平的鼻黏膜sIgA以及血清IgG[10]。

A line F O liveira,Roque-Barreira等構(gòu)建了R.equi(馬紅球菌)VapA抗原的重組沙門菌疫苗株。R.equi感染小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),與非免疫小鼠相比:口服免疫小鼠呈現(xiàn)出了3～7倍的病原清除能力;感染后10 d,血液中病原菌數(shù)低50倍;急性感染期以及壞疽期,肝的肉芽腫降低 2倍,血清中 anti-VapA IgG2a的水平明顯升高[11]。

Kulkarni R R,Parreira V R等用制備的表達(dá)產(chǎn)氣梭菌 FBA(fructose-biphosphate-aldolase)和HP(hypothetical protein)的重組沙門菌疫苗免疫肉雞后,可以明顯的降低肉雞壞疽性腸炎的發(fā)生,使雞獲得抵抗梭菌的能力[12];Simon MCutting,Jen-Min Huang等用構(gòu)建的沙門菌載體結(jié)核疫苗免疫小鼠時(shí),產(chǎn)生了強(qiáng)烈的MPT64抗原的細(xì)胞免疫應(yīng)答,對(duì)結(jié)核菌的感染有較強(qiáng)的保護(hù)作用[13]。

3.2 沙門菌載體重組疫苗在病毒中的應(yīng)用 Ai-Li Shiau,Chao-Liang Wu等克隆了豬的ProT cDNA(前胸腺素反轉(zhuǎn)錄基因),并且用低毒的S choleraesuis攜帶 ProT的重組質(zhì)粒。結(jié)果顯示,重組S.choleraesuis在小鼠中可以表達(dá)ProT,誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答[14]。

Jian-Fang Ning,Xiao-Lin Meng等使用沙門菌株SV 4089作為小龍蝦白點(diǎn)綜合征病毒(WSSV)DNA疫苗質(zhì)粒的細(xì)菌載體,免疫結(jié)果顯示疫苗得到了較好的呈遞和釋放[15]。試驗(yàn)說(shuō)明減毒沙門菌可以作為疫苗載體應(yīng)用到節(jié)肢動(dòng)物中。

Aaron PWhitem,Shu-Lin Liu等以沙門菌為載體的hepatitis B virus x gene(HBX)疫苗免疫小鼠,出現(xiàn)了明顯的CTL效應(yīng)以及IFN-γ分泌型T細(xì)胞的增多。用表達(dá)有HBX的黑色素瘤細(xì)胞攻擊小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),免疫小鼠黑色素瘤的增長(zhǎng)速度、大小以及重量與未免疫小鼠有明顯的差異[16]。

4 存在的問(wèn)題及展望

與其他弱毒菌株一樣,弱毒沙門菌作為載體有毒力返強(qiáng)的問(wèn)題,并且可能存在著微弱的致病性,在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制。作為載體使用的弱毒沙門菌菌株較少,在一定程度上限制了沙門菌載體重組疫苗的研究與發(fā)展。

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,以及對(duì)沙門菌毒力的深入研究,將會(huì)促進(jìn)弱毒沙門菌的研究進(jìn)程,更多的穩(wěn)定沙門菌弱毒株將會(huì)應(yīng)用到載體疫苗的研制中。沙門菌載體疫苗的臨床應(yīng)用,將會(huì)簡(jiǎn)化免疫程序,節(jié)省大量的人力、物力。為野生動(dòng)物的免疫保護(hù)提供一種新的思路。

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