登革熱血清學(xué)診斷研究進(jìn)展*

譚 俊,楊亞明,周紅寧

登革熱(dengue fever,DF)是由黃病毒屬的登革病毒(dengue virus,DENV)通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播引起的一種急性蚊媒傳播疾病,現(xiàn)已成為全球性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。目前登革病毒診斷方法主要包括病毒分離、分子生物學(xué)檢測和血清學(xué)方法。其中,前者作為登革病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn),不但可以檢出病毒的存在,還能對(duì)病毒的型別進(jìn)行鑒定,但該方法比較耗時(shí),而且需要一定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員[1];從 Banditti早期報(bào)道的巢式RT-PCT檢測到現(xiàn)在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的應(yīng)用以及核酸序列擴(kuò)增技術(shù),分子生物學(xué)檢測技術(shù)在這近十幾年來有了較大的發(fā)展,其敏感性、特異性和重復(fù)性都有了很大的提高,但該方法也存在較高的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員要求;而利用抗原或抗體檢測原理的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,具有操作方便、試劑廉價(jià)、診斷快速等特點(diǎn),較適用于現(xiàn)場診斷,并得到了廣泛的應(yīng)用。

登革病毒的血清學(xué)診斷方法主要包括血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)試驗(yàn),中和試驗(yàn)(Neutralization Test,NT)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(Indirect Immunofluorescent Assay,IIF)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、補(bǔ)體固定試驗(yàn)(Complement fixation,CF)、斑點(diǎn)印跡、免疫層析法(Immunochromatographic Test,ICT)等。這些方法主要就是對(duì)抗原(ELISA、斑點(diǎn)印跡、ICT)或者抗體(HI、NT、IIF、CF、ELISA、ICT、斑點(diǎn)印跡)進(jìn)行檢測。大量的應(yīng)用實(shí)踐發(fā)現(xiàn),目前最常用的方法主要為 ELISA、ICT和比較傳統(tǒng)的HI試驗(yàn)及NT試驗(yàn)。

1 抗原檢測

在初次和二次感染的患者急性期血清中都可以通過酶聯(lián)反應(yīng)和斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測到高濃度、以免疫復(fù)合物形式存在的包膜蛋白(envelope,E)/膜蛋白(membrane,M)抗原和非結(jié)構(gòu)蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)抗原,甚至在患者發(fā)病后9d仍能檢測到這些抗原[2]。前者(envelope,E)是登革病毒的主要包膜蛋白,全長494個(gè)氨基酸,相對(duì)的分子量近60000;不但含有中和抗原表位、型特異表位,還有登革病毒種及黃病毒屬特異性表位。E蛋白的A、B兩區(qū)存在與中和抗體和血凝作用有關(guān)的抗體表位,可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體以及血凝抑制抗體[3]。此外,該蛋白還可能會(huì)引起抗體依賴的增強(qiáng)感染作用(ADE),而ADE可導(dǎo)致DHF和DSS的產(chǎn)生。M蛋白(membrane,M)形成病毒毒粒的表面結(jié)構(gòu),分子量約為8000,由其前體PrM糖蛋白經(jīng)過特異性酶切后形成;研究發(fā)現(xiàn),M蛋白具有促進(jìn)病毒感染增強(qiáng)的作用[4]。NS1蛋白屬于登革病毒中一種高度保守的非結(jié)構(gòu)性糖蛋白,具有較高的同源性,分為包內(nèi)型、膜型和分泌型。研究發(fā)現(xiàn)其抗原性很強(qiáng),含有多個(gè) T、B細(xì)胞表位,能夠誘發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,此外,在登革熱病人的血清中還存在較高水平的循環(huán)NS1抗原和NS1特異性抗體[5-7],且出現(xiàn)時(shí)間也早于IgM 抗體[8]。Sophie Alco等人通過研究發(fā)現(xiàn),甚至在檢測不到登革病毒RNA或已有登革病毒IgM抗體存在的情況下,也可能有效檢測出NS1蛋白;他們對(duì)登革病毒感染者一出現(xiàn)發(fā)熱到臨床期結(jié)束的整個(gè)過程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),登革病毒NS1蛋白均能在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)的病人血清中檢測到,只不過各個(gè)時(shí)間段NS1蛋白滴度含量有所不同[9]。

目前針對(duì)E/M蛋白和NS1蛋白檢測的方法主要有ELISA和斑點(diǎn)免疫測定,其中ELISA法較為常用[10]。2006年徐華等人采用DEN-1 NS1抗原捕獲ELISA的方法,對(duì)16例臨床診斷為DEN1感染患者急性期的血清樣品進(jìn)行檢測;并把 DEN-1 NS1抗原檢測陽性樣本品15份與試劑盒IgM抗體(澳大利亞PanBio)檢測結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),兩種方法檢測結(jié)果中有13例吻合(即IgM抗體和DEN1-NS1抗原檢測同時(shí)陽性);其余2例IgM抗體陰性,而DEN1-NS1抗原檢測呈陽性,結(jié)果提示該方法在登革熱的發(fā)病早期檢出效果可能要優(yōu)于IgM抗體的檢測[11]。陳萬山等人分別采用傳統(tǒng)的病毒分離鑒定法、RT-PCR法以及IgM抗體檢測法與ELISA捕獲NS1抗原檢測法進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn),在登革病毒感染患者發(fā)病1～2d、3～5d以及6～10d的血清中,NS1抗原的檢出率分別是92.7%(38/41)、83.3%(70/84)、10.9%(5/46),特異性為 100%;而 IgM抗體檢測方法分別為 2.4%(1/41)、51.2%(43/84)、97.8%(45/46),特異性為95.2%;RT-PCR 法在發(fā)病的1～2d,與ELISA檢測NS1法結(jié)果的差異性不大(P＞0.05);但病毒分離方法比NS1抗原方法的檢出率要低(P＜0.05)[12]。

此外,Philippe Dussart采用ICT檢測NS1法(Dengue NS1 Ag STRIP)和兩步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(pan-E Dengue Early ELISA)與一步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(the Platelia Dengue NS1 Ag Test)進(jìn)行檢測比較發(fā)現(xiàn),Dengue NS1 Ag ST RIP檢測法的敏感性和特異性分別為76.1%(207/272)和 100%(48/48);而 pan-E Dengue Early ELISA檢測法的敏感性和特異性分別為 55.1%(150/272)和 97.9%(47/48);the Platelia Dengue NS1 Ag test的敏感性和特異性分別為 82.4%(224/272)和 100%(48/48)[13]。該比較結(jié)果說明the Platelia Dengue NS1 Ag test是三者中檢測效果最好的,可作為早期診斷DEN感染的方法。

2 抗體檢測

登革感染者血清中的抗體檢測常見的有血凝抑制(Hemagglutination-inhibition)抗體、中和(Neutralization)抗體、IgM 和IgG。其中,血凝抑制抗體是一種能夠抑制登革病毒促使紅細(xì)胞發(fā)生凝集現(xiàn)象的特異性抗體,長期以來測定血凝抑制抗體的血凝抑制試驗(yàn)(HI)被廣泛應(yīng)用于登革病毒感染的檢測。一般初次感染者急性階段的抗體多在發(fā)病后第5～6d才可檢測到(抗體滴度通常大于1∶10);而對(duì)于二或三次感染時(shí),抗體滴度通常在發(fā)病后第1d就會(huì)迅速上升(一般大于1∶24),因此,急性期血清標(biāo)本抗體滴度在1∶1 280以上時(shí),提示近期有登革病毒感染[14-15]。但最近有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),針對(duì)登革病毒的初次和二次感染者,HI試驗(yàn)和EILSA試驗(yàn)的檢測結(jié)果吻合率僅有88%,其原因還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)[16]。中和抗體是當(dāng)人體感染登革病毒后所產(chǎn)生的一種保護(hù)性抗體,可以抑制登革病毒的吸附、穿入、從而使其失去感染能力。傳統(tǒng)檢測中和抗體的實(shí)驗(yàn)方法多為空斑減少中和試驗(yàn),該實(shí)驗(yàn)具有較高的敏感性和特異性,特別是針對(duì)于初次感染的血清型鑒定。但對(duì)于二或三次感染者,由于原始抗原痕跡(original antigenic sin,OAS)作用的存在,使中和抗體試驗(yàn)的可靠性明顯降低[17-18]。因此,該實(shí)驗(yàn)只適用于初次感染的登革熱診斷[14]。

一般來說,初次感染登革病毒,IgM通常在發(fā)病后的5d出現(xiàn),1～3周內(nèi)達(dá)到高水平,并可維持2個(gè)月,有的甚至在6個(gè)月時(shí)還能檢測到;而IgG抗體的出現(xiàn)時(shí)間要比IgM晚,多在感染后的2周出現(xiàn),并可維持終生。在二次感染時(shí),IgM則出現(xiàn)的比較晚,且所產(chǎn)生的水平也較低,維持的時(shí)間也不長,常使得一些患者較難檢測到IgM;而IgG的產(chǎn)生時(shí)間就很快,一般是在出現(xiàn)癥狀后的1～2d出現(xiàn),且抗體水平也比既往的要高。為此,在實(shí)際應(yīng)用中,對(duì)于初次登革病毒的檢測,IgM一般用于檢測發(fā)病后1周所采集的血液,發(fā)病2周后采集的血液就可以采取IgG抗體檢測;對(duì)于二次感染,在檢測可疑病人的血清時(shí),建議同時(shí)檢測IgM和IgG兩種抗體[14]。

目前對(duì)兩種IgM和IgG抗體檢測的主要方法有ELISA法、ICT以及IIF(主要檢測IgG)。其中,以膠體金快速免疫層析法為代表的ICT檢測法是目前較常用的現(xiàn)場快速診斷方法。一方面它對(duì)登革熱的診斷速度快,僅需5～10min而且不需要特定的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員,在現(xiàn)場就可以完成檢測;另一方面采用該方法既可檢測IgM,又可檢測IgG,而且對(duì)是否初次或二次感染都可做出初步判斷[19-20]。Lam和Devine早在1998年就提出快速免疫層析法對(duì)早期快速診斷登革熱感染是非常有價(jià)值的。他們用快速免疫層析試驗(yàn)和ELISA捕獲法在登革感染期間,對(duì)IgM 和IgG抗體進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種方法的敏感性和特異性都較高,分別為100%和 89%[21]。David W.Vaughn和 Ananda Nisalak等人用ICT對(duì)登革病毒感染患者的血清檢測IgM和IgG抗體時(shí)發(fā)現(xiàn),其敏感性和特異性也分別高達(dá)100%和88%[19]。何似、陳潤等人采用ICT和IIF對(duì)56份疑似登革熱病人的血清和68份無癥狀人群的血清分別進(jìn)行了IgG的檢測,在前者血清的兩種檢測方法比較中發(fā)現(xiàn),IIF法檢測的陽性率為53.6%(30/56),ICT檢測的陽性率為46.4%(26/56),兩法符合率 91.07%,無顯著差異(P＞0.05);但在后者血清的檢測中,IIF法檢查的陽性率為 54.4%(37/68),而 ICT檢測得陽性率為33.8%(23/68);兩法符合率73.53%,存在顯著差異(P＜0.01)[22]。此外,徐建民采用抗體捕獲ELISA法和快速免疫層析法分別對(duì)2000年的322份標(biāo)本(其中4份確診為登革熱病人)和1999年的311份標(biāo)本(其中2份確診為登革熱病人)進(jìn)行了檢測,通過對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)的比較揭示,快速免疫層析法特別適于在登革熱暴發(fā)流行期間作初篩試驗(yàn)[23]。

3 束 語

近十幾年來,血清學(xué)試驗(yàn)技術(shù)有了迅速的發(fā)展,之間不斷有新的檢測技術(shù)出現(xiàn)。如捕獲NS1抗原的ELISA法,其靈敏值可達(dá)到10ng/ml。Sophie Alcon等建立了類似檢測NS1蛋白的方法,參比蛋白采用1型登革病毒NS1蛋白,包被抗體和酶標(biāo)抗體分別為抗登革病毒1型鼠多克隆抗血清和兔多克隆抗血清,該方法甚至可以檢測到含量低于 1ng/mL的DEN-1 NS1蛋白,但同樣的檢測水平對(duì)于其它型的NS1蛋白不成立,其敏感性可低至10倍[9]。這種差異可能是所用的多抗血清只針對(duì)DEN-1 NS1蛋白,由于登革病毒NS1蛋白的氨基酸序列同源性并不是很高(一般不超過80%),使得該多抗血清與其它型的登革病毒NS1蛋白的反應(yīng)效率降低[24]。因此,使用針對(duì)某一種型別的NS1抗原不但可以提高該型登革病毒檢測方法的靈敏性,還有可能對(duì)病毒的型別進(jìn)行鑒定。最近研究報(bào)道,針對(duì)于I型和III型登革病毒的NS1特異性單抗已經(jīng)成功制備[11,25];這些都預(yù)示著ELISA捕獲NS1抗原檢測法在未來可以作為早期檢測登革病毒的首選方法。但是該方法目前仍不能對(duì)初次或再次感染情況進(jìn)行判斷,這還有待進(jìn)一步的研究。而快速免疫層析法(ICT),雖然對(duì)初次或二次感染都可作出初步判斷,并具有診斷時(shí)間快、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),但該方法在病例散發(fā)情況下或?qū)o癥狀人群檢測時(shí),出現(xiàn)的假陽率比較高,而且有些病人在感染后的7～10d內(nèi),抗體水平也較低;只有當(dāng)病人癥狀持續(xù)出現(xiàn)時(shí),再次采樣測試,才會(huì)有較好的效果[22-23]。此外,該方法不能對(duì)登革病毒的型別進(jìn)行鑒定,仍然需要依靠RT-PCR、病毒分離等方法來完成[26]。

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