沙門氏菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展＊

黃靜瑋,汪銘書,程安春

沙門氏菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展＊

黃靜瑋1,2,3,汪銘書1,2,3,程安春1,2,3

自1885年Salmon等分離得到豬霍亂沙門氏菌以來,目前已檢出沙門氏菌血清型2500余種,我國(guó)已有292個(gè)血清型報(bào)道[1]。沙門氏菌是重要的人獸共患病病原菌之一,本文就沙門氏菌基因組學(xué)、鞭毛蛋白、外膜蛋白以及毒力島等方面研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié),以期為開展相關(guān)研究提供參考。

1 基因組特征

研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌具有屬特異性基因、血清群特異性基因及血清型特異性基因。屬特異性基因包括 inv、hut、hns、spv、fim、hilA 、16SrDNA 等[2],血清群特異性基因主要為 rfb,血清型特異性基因包括 f liC、f ljB、via等,filC可作為甲型副傷寒沙門氏菌特異性檢測(cè)基因[3]。

分析副傷寒沙門氏菌基因組發(fā)現(xiàn),其與鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等沙門氏菌間約有90%的共同基因,而生物學(xué)性狀差異主要由10%左右的基因決定,這10%的基因結(jié)構(gòu)常具有可塑性,可以不同方式重組表現(xiàn)不同功能[4]。與其他沙門氏菌相比,副傷寒沙門氏菌與傷寒沙門氏菌基因具有更高的同源性。丙型副傷寒沙門氏菌RK4594高分辨圖譜,與傷寒沙門氏菌L T2圖譜相似[5]。甲型副傷寒沙門氏菌SPA-2-Sop E與傷寒沙門氏菌Sop E高度相似[6],其差異主要在于前噬菌體和假基因。通過假基因的形成、密碼子替換、突變、基因缺失可導(dǎo)致甲型副傷寒沙門氏菌小序列的多樣性和基因功能改變,從而使其在感染宿主過程中可尋找更適合的靶位置。有報(bào)道指出在甲型副傷寒沙門氏菌存在43個(gè)特異性蛋白質(zhì)編碼序列以及多種小片段的隱藏質(zhì)粒 ,stk F、spa2473、spa2539、hsdM 是其特異性的靶位點(diǎn)[7]。

Hfq與沙門氏菌毒力密切相關(guān),超過30%的非編碼sRNA可與 Hfq蛋白結(jié)合,從而影響 RNA的穩(wěn)定性或通過輔助非編碼sRNA與m RNA結(jié)合以調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)[8]。Hfq與 RNase結(jié)合形成的降解復(fù)合體,可同時(shí)降解 sRNA和m RNA,以抑制目的基因表達(dá)。此外 Hfq還能夠影響多種細(xì)菌外毒素表達(dá)[9]。

2 外膜蛋白

外膜蛋白可分為主要蛋白:微孔蛋白、脂蛋白、OmpA、OmpB、OmpC、Omp F和微量蛋白。

2.1 編碼外膜蛋白核苷酸的同源性 通過外膜蛋白抗原相似性的高低,可判斷細(xì)菌親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。沙門氏菌外膜蛋白基因表達(dá)和抗原性具有較高的相似性,不同地區(qū)沙門氏菌DNA往往可以編碼同一種外膜蛋白,但沙門氏菌外膜蛋白編碼基因也可通過后天獲得[10]。外膜蛋白的表達(dá)常由sRNA調(diào)節(jié),目前已發(fā)現(xiàn)8個(gè)OM P調(diào)節(jié) sRNA:InvR、M icA、M icC、M icF、Om rAB、RseXand、RybB,但具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚未明確[11]。與OmpC和Omp F高水平表達(dá)相比ompS1、omp S2編碼的孔蛋白僅處于低水平表達(dá)狀態(tài)。OmpB、OmpC、Omp F、OmpS1、Omp S2 在表達(dá)過程中相互作用,并且受LeuO、H-NS、M icC、M icF、hfq、OmpR/EnvZ、Rcs系統(tǒng)等調(diào)控[12-13]。在高滲應(yīng)激條件下hfq與OmpR/EnvZ、Rcs系統(tǒng)存在交叉調(diào)節(jié),但具體機(jī)制尚未明確。

Omp S1有 3個(gè)操縱子:Pl、P2、P3。Pl控制OmpR的起始表達(dá),只有在 Pl存在時(shí)OmpR才會(huì)表達(dá);當(dāng)OmpR缺失,P2參與Omp S的低水平表達(dá);P3有微弱的連續(xù)的活性,對(duì)Omp R表達(dá)起輔助作用[14]。OmpS1的基因表達(dá)既不受滲透壓誘導(dǎo),也不受負(fù)調(diào)控機(jī)制中的IHF調(diào)節(jié)子的影響,與大腸埃希菌 K-12有一定的同源性,均具有開放式閱讀框架。

2.2 外膜蛋白的免疫學(xué)特性 副傷寒沙門氏菌外膜蛋白 PagC、Omp X、NmpC、FadL、TolC 和 BtuB等均具有較強(qiáng)的免疫原性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的免疫應(yīng)答,尤其以O(shè)mpC介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答為甚,當(dāng)外膜蛋白以非共價(jià)鍵與肽聚糖緊密結(jié)合,形成相對(duì)非特異性的通道時(shí)具有高度的保守性[12]。

3 鞭毛蛋白

沙門氏菌鞭毛蛋白可引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,是沙門氏菌重要的致病因素,可在不同環(huán)境中表達(dá)出不同類型。鞭毛蛋白是沙門氏菌鞭毛絲狀部的結(jié)構(gòu)蛋白(即 H抗原),由fliC或fljB編碼[15]。

3.1 分型 H抗原 H抗原可分Ⅰ和Ⅱ相,Ⅰ相特異性高且抗原性存在較大差異,Ⅱ相特異性低且為多種沙門氏菌所共有。H1抗原在沙門氏菌中普遍存在,經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同血清型沙門氏菌重 H 1鞭毛蛋白決定細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和功能的兩端的氨基酸序列高度保守,而決定細(xì)菌的血清型得中間區(qū)高度變異,IV、V I區(qū)的同源性分別低于27%、39%。

甲型副傷寒桿菌鞭毛蛋白僅有 I相 H抗原a(H la),H1a與鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FIiC的核苷酸及氨基酸序列高度相似[16]。甲型副傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白FliC與傷寒桿菌等沙門氏菌鞭毛蛋白具有相同的抗原決定簇,存在明顯的抗原和抗體交叉,可結(jié)合 TOLL樣受體-5,常與 CD4+/CD8+T細(xì)胞相互作用[17]。甲型副傷寒沙門氏菌 H la、FliC、SpaO蛋白單克隆抗體對(duì)實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物均有明顯保護(hù)作用,在自然感染病人血清中也能檢出相應(yīng)抗體。但通過鞭毛基因 FliC測(cè)序以及對(duì) I相鞭毛抗原進(jìn)行基因血清分型和鑒定發(fā)現(xiàn)在分子水平上并不能把 H∶d和 H∶z42以及 H∶g、q和 H∶g、m、q區(qū)分開[18]。

3.2屬特異性共同抗原 沙門氏菌鞭毛蛋白上存在屬特異性抗原決定簇,其共同抗原表位是沙門氏菌屬的識(shí)別標(biāo)志,具有高度屬特異性和屬內(nèi)保守性。屬特異性共同抗原同時(shí)存在于 I相及Ⅱ相鞭毛;在屬內(nèi)同源性較高且廣泛存在,而屬間出現(xiàn)的頻率很低且不受鞭毛位相改變的影響。但不同于O抗原和H分型抗原的分布特征,沙門氏菌鞭毛上可存在多個(gè)屬特異性抗原表位。屬特異共同抗原免疫原性較好,但其免疫性比分型 H抗原弱,提示沙門氏菌分型H抗原表位是鞭毛蛋白分子上的優(yōu)勢(shì)表位。

4 毒力島及Ⅲ型分泌系統(tǒng)

4.1 毒力島 沙門菌毒力島(SPI)指與沙門氏菌侵襲力相關(guān)的毒力基因及操縱子聚集成簇分布于細(xì)菌染色體的某些特定區(qū)域,而這些毒力基因在染色體組成相似的大腸埃希菌中并不存在。目前研究最廣泛的是 SPI-1、SPI-2、SPI-3、SPI-4 和 SPI-5,而在傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌中新鑒定出的 SPI-6、SPI-7、SPI-9、SPI-11、SPI-12、SPI-17被陸續(xù)報(bào)道[6]。各島的各種毒力基因均受dam、pho P/phoQ等調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié),若刪除調(diào)節(jié)基因,細(xì)菌毒力將大大降低[19]。

SPI-1 含 inv、hil、org、spt、spa、sip、iag、iae、prg、sic基因[20-21],編碼包括調(diào)節(jié)子和分泌性效應(yīng)蛋白在內(nèi) T3SS的各種成分,其效應(yīng)蛋白與細(xì)菌和宿主細(xì)胞的粘附有關(guān),可引起腸黏膜細(xì)胞上的肌動(dòng)蛋白發(fā)生重排,有利于沙門氏菌的內(nèi)化。其表達(dá)受HilA、HilD、InvF、inv/spa、p rg操縱子和 pp Gpp 調(diào)控[22-23],Hfq可在 SPI-1基因表達(dá)中擴(kuò)增[8],并受PL lacO-1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)[24],是 InvR積聚的關(guān)鍵,但其對(duì)sRNA編碼區(qū)域的毒性尚未明確。InvR由轉(zhuǎn)錄子 HilD,HilC激活,同時(shí) HilD,HilC可拮抗 HilA作用[25]。

SPI-1編碼的蛋白質(zhì)可入侵宿主非吞噬細(xì)胞,離體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡,在沙門氏菌侵襲巨噬細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。

SPI-2的含4個(gè)操縱子:ssa編碼 T3SS成分,ssr編碼分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)子,ssc編碼分子伴侶,sse編碼分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白[26]。H-NS是SPI-2分泌的主要蛋白,與A T含量豐富的區(qū)域結(jié)合,表達(dá)主要受IHF、Fis、PhoP、SpiR/SsrB、ydg T/SsrB、hha/SsrB調(diào)控[27-29]。SPI-2可控制沙門氏菌在吞噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,并使沙門氏菌逃避巨噬細(xì)胞輔酶Ⅱ依賴的殺傷作用。

SPI-3含10個(gè)開放閱讀框,組成6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位,其中mgtCB的產(chǎn)物編碼的M g2+轉(zhuǎn)運(yùn)子可介導(dǎo)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞和低M g2+環(huán)境中存活[30]。

SPI-4含18個(gè)開放閱讀框,但大多表現(xiàn)為SiiA至F6個(gè)開放閱讀框,其中SiiE是最主要分泌的蛋白,主要由 I型分泌系統(tǒng)分泌,其調(diào)控與 SPI-1相關(guān),編碼介導(dǎo)毒素分泌的I型分泌系統(tǒng),并參與調(diào)節(jié)細(xì)菌適應(yīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,但具體功能有待研究[31]。

SPI-5含 sop、sig、pip,編碼參與腸粘膜液體分泌和炎癥反應(yīng)的相關(guān)蛋白,并且由 SPI-1和SPI-2編碼的蛋白所調(diào)控[32]。

另外在丙型副傷寒沙門氏菌中新鑒定出的SPI-7長(zhǎng) 134kb,含 Sop E噬菌體、viaB操縱子、phoN基因、一個(gè)臨近 tRNA pheU位點(diǎn)的75kb的片段和一個(gè)編碼 IV型鞭毛的區(qū)域的鉤端螺旋體。當(dāng)DNA片段插入基因序列,可改變基因平衡狀態(tài),以優(yōu)化基因結(jié)構(gòu),對(duì)DNA轉(zhuǎn)化、活化以及穩(wěn)定性保護(hù)存在一定功能[33]。

4.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS) Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是SPI-1和SPI-2編碼特異性的蛋白分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),包括至少20種內(nèi)膜蛋白及外膜蛋白。沙門氏致病的毒力因子由20～50個(gè)基因組成的基因簇編碼的 T3SS分泌的蛋白和其靶蛋白組成,這些毒力因子直接或間接刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào),引起一系列細(xì)胞反應(yīng)[34]。

T3SS蛋白分子量大多在26～85kDa之間,普遍含外膜蛋白 InvG、PrgH和 Prg K,內(nèi)膜蛋白 InvA、SpaP、SpaQ、SpaR 和 SpaS,附屬蛋白 SicA、Inv I、IacP、InvH和OrgA。可按功能將其分為兩類:一類發(fā)揮蛋白分泌功能,另一類將蛋白轉(zhuǎn)送到宿主細(xì)胞的效應(yīng)分子,這兩個(gè)系統(tǒng)具有很高的同源性,其中InvJ和SpaO是 T3SS必需的特異性蛋白,SipB和SipC是沙門氏菌進(jìn)入宿主細(xì)胞的功能蛋白[35]。電子顯微鏡分析表明,SPI-1編碼的 T3SS是一種在生化和結(jié)構(gòu)上均類似于細(xì)菌鞭毛系統(tǒng)的“針狀復(fù)合物”,該復(fù)合物編碼的 Prg K、PrgH、InvG,、InvA、Prg I、Prg K等,PrgH或InvG的突變可導(dǎo)致細(xì)菌入侵非吞噬的上皮細(xì)胞所必需的效應(yīng)蛋白 SipA、SipB、SipC、SipD等分泌受阻[35]。SPI-1分泌的 Sip A、SipC、Sop E、Sop E2和 SopB通過調(diào)節(jié)宿主肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,促使細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞[21]。SPI-2效應(yīng)蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的移動(dòng),關(guān)系到細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活。

T3SS的調(diào)控主要受時(shí)間和空間的限制,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制在與宿主細(xì)胞相互接觸后發(fā)揮其功能,入侵基因表達(dá)的調(diào)控由轉(zhuǎn)錄水平的環(huán)境因素決定的。目前,在分子水平僅發(fā)現(xiàn)DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)影響蛋白的分泌。在蛋白水平 InvF和 HilA參與沙門氏菌的入侵。InvF屬于轉(zhuǎn)錄激活子A raC家族;HilA屬于轉(zhuǎn)錄激活子Omp R/ToxR家族,HilA又調(diào)節(jié)orgA、sipC和invF,它們形成一個(gè)調(diào)控莖環(huán)結(jié)構(gòu)[36]。此外,T3SS還受到調(diào)控網(wǎng)的影響,如菌毛調(diào)控系統(tǒng)、PhoP/PhoQ[27]調(diào)控系統(tǒng)和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白等。

5 展 望

沙門氏菌是目前研究較為廣泛的人獸共患病致病菌之一,但對(duì)沙門氏菌的研究主要集中于沙門氏菌屬的相關(guān)研究,而對(duì)于沙門氏菌單獨(dú)的種以及亞種等的特異性研究相對(duì)較少。雖然已知沙門氏菌不同種的基因組之間具有較高相似性,但具有種特異性的基因?qū)皇置鞔_,因此篩選種特異性基因有利于建立特異性檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)對(duì)沙門氏菌菌種的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及監(jiān)測(cè)控制。另外,闡明尙不清楚的沙門氏菌外膜蛋白、鞭毛蛋白、SPI、T3SS的基因及蛋白相互調(diào)節(jié)的機(jī)制,對(duì)于闡明其分子致病機(jī)制、研發(fā)新藥及疫苗有著重要指導(dǎo)意義,應(yīng)該成為今后的重點(diǎn)研究方向之一。

[1]彭海濱.我國(guó)沙門菌污染分布概況[J].中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志2006,29(2):125-128.

[2]Yoshida C.Methodologies towards the development of an oligonucleotide microarray for determ ination of Salmonella serotypes[J].Journal of Microbiological Methods,2007,70(2):261-271.

[3]A li A.Nested PCR based diagnosis of Salmonella enterica serovar Paratyphi A directly from blood samples[J].Pak J Med Sci July-Sep tember,2008,24(4):545-549.

[4]Holt K.Pseudogene accumulation in the evolutionary historiesof Salmonella enterica serovars Paratyphi A and Typhi[J].BMC Genomics,2009,10(1):36.

[5]Wei-Qiao L.Diverse genome structuresof Salmonella paratyphi C[J].BMC Genomics,2007:8.

[6]Didelot X.A bimodal pattern of relatedness between the Salmonella Paratyphi A and Typhi genomes:Convergence or divergence by homologous recombination[J].Genome Research,2007,17(1):61.

[7]Ou H.Translational genomics to develop a Salmonella enterica serovar Paratyphi A multip lex polymerase chain reaction assay[J].Journal of Molecular Diagnostics,2007,9(5):624.

[8]Sittka A.The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium[J].Molecular Microbiology,2007,63(1):193.

[9]Papenfort K,Vogel J.M ultip le target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level[J].Research in Microbiology,2009,160(4):278-287.

[10]Guillier M,Gottesman S,Storz G.Modulating theoutermembrane with small RNAs[J].Genes&Development,2006,20(17):2338.

[11]Mandin P.Identification of new noncoding RNAs in L isteria monocytogenes and p rediction of m RNA targets[J].Nucleic Acids Research,2007,35(3):962.

[12]Hamid N,Jain S.Characterization of an outer membrane protein of Salmonella enterica serovar typhimurium that confers p rotection against Typhoid[J].Clinical and Vaccine Immunology,2008,15(9):1461.

[13]MacRitchie D.Two-component signaling and gram negative envelope stress response systems[M].Bacterial signal transduction:netwo rks and drug targets,2008:80-110.

[14]Oropeza R.Negative and positive regulation of the non-osmoregulated ompS1 porin gene in S.typhi:a novel regulatory mechanism that involves OmpR[J].Mol Microbiol,1999,32:243-252.

[15]Simon R,Samuel C.Activation of NF-[kappa]B-dependent gene expression by Salm onella f lagellins FliC and FljB[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,355(1):280-285.

[16]Parkhill J.Complete genome sequenceof amultiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18[J].Nature,2001,413(6858):848-852.

[17]Oropeza R,Calva E.The cysteine 354 and 277 residuesof Salmonella enterica serovar Typhi EnvZ are determinants of autophosphorylation and OmpR phosphorylation[J].FEMSM icro-biology Letters,2009,292(2):282-290.

[18]Sonne-Hansen J,Jenabian S.Molecular serotyping of Salmonella:Identification of the phase 1 H antigen based on partial sequencing of the fliC gene[J].Apmis,2005,113(5):340-348.

[19]Marcus S.Salmonella pathogenicity islands:big virulence in small packages[J].Microbes and Infection,2000,2(2):145-156.

[20]Virlogeux-Payant I.TolC,but not AcrB,is involved in the invasiveness of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium by increasing type III secretion system-1 expression[J].International Journal of Medical Microbiology,2008,298(7-8):561-569.

[21]Lara-Tejero M,Galan J.Salm onella enterica serovar typhimurium pathogenicity island 1-encoded type IIIsecretion system translocasesmediate intimate attachment to nonphagocytic cells[J].Infection and Immunity,2009,77(7):2635.

[22]Pfeiffer V.A small non-coding RNA of the invasion gene island(SPI-1)rep resses outer membrane protein synthesis from the Salmonella core genome[J].Molecular Microbiology,2007,66(5):1174-1191.

[23]Thompson A.The bacterial signal molecule,pp Gpp,mediates the environmental regulation of both the invasion and intracellular virulence gene p rograms of Salmonella[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(40):30112.

[24]U rban J,Vogel J.Translational control and target recognition by Escherichia coli small RNAs in vivo[J].Nucleic Acids Research,2007,35(3):1018-1037.

[25]Ellermeier J,Slauch J.Adaptation to the host environment:regulation of the SPI1 type III secretion system in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Current Opinion in Microbiology,2007,10(1):24-29.

[26]Coombes B.SseL is a salmonella-specific translocated effector integrated into the SsrB-controlled salmonella pathogenicity island 2 type III secretion system[J].Infection and Immunity,2007,75(2):574.

[27]Kong W,Weatherspoon N,Shi Y.Molecular mechanism for establishment of signal-dependent regulation in the PhoP/PhoQ system[J].Journal of Biological Chemistry,2008,283(24):16612.

[28]Bustamante V.HilD-mediated transcrip tional cross-talk betw een SPI-1 and SPI-2[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(38):14591.

[29]Silphaduang U.Rep ression of intracellular virulence factors in Salmonella by the Hha and Ydg T nucleoid-associated proteins[J].Journal of Bacteriology,2007,189(9):3669.

[30]Chiu C.The genome sequence of Salmonella enterica serovar Choleraesuis,a highly invasive and resistant zoonotic pathogen[J].Nucleic Acids Research,2005,33(5):1690.

[31]Gerlach R.Salmonella pathogenicity island 4 encodes a giant non-fimbrial adhesin and the cognate type 1 secretion system[J].Cellular Microbiology,2007,9(7):1834-1850.

[32]Knodler L.Salmonella effectors within a single pathogenicity island are differentially expressed and translocated by separate type III secretion systems[J].Molecular Microbiology,2002,43(5):1089-1103.

[33]Liu G.Genome plasticity and ori-ter rebalancing in Salmonella typhi[J].Molecular Biology and Evolution,2006,23(2):365.

[34]Schlumberger M,Hardt W.Salmonella type III secretion effectors:pulling the host cell’s strings[J].Current Opinion in Microbiology,2006,9(1):46-54.

[35]Galkin VE,Schmied WH,Schraidt O,et al.The Structure of the Salmonella typhimurium type III secretion System need le show s divergence from the flagellar system[J].Journal of Molecular Biology,2010,396(5):1392-1397.

[36]Main-Hester K.Coordinate regulation of Salmonella pathogenicity island 1(SPI1)and SPI4 in Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Infection and Immunity,2008,76(3):1024.

1002-2694(2011)07-0649-04

R378.2

A

＊教育部“長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT0848)

程安春,Email:chenganchun@vip.163.com

1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病防治研究中心,雅安625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雅安 625014;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)研究所

2010-11-06;

2011-04-25