鹽酸克倫特羅殘留檢測方法研究進展

李慶華 陳 肖 彭道和 肖幼榮

（1.湖北省鄂州市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄂州 436000；2.湖北省鄂州市杜山畜牧獸醫(yī)站，鄂州 436000；3.湖北省鄂州市城區(qū)動物檢疫站，鄂州 436000）

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLB），俗稱“瘦肉精”，別名克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯醇胺、氨雙氯喘通，是一種平喘藥，屬于β-興奮劑。該藥分子式為C12H18Cl2N2O-HCl，分子量為313.7，為白色或類白色的結(jié)晶粉末，無臭、味苦，熔點161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。CAS號：37148-27-9。

20世紀(jì)70年代末，美國等發(fā)達國家開始將CLB用作“營養(yǎng)重分配劑”及“促生長劑”的實用性開發(fā)研究；20世紀(jì)80年代被廣泛應(yīng)用到畜禽生產(chǎn)中。研究顯示克倫特羅能增強脂解和減慢蛋白質(zhì)分解代謝，可明顯提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率；但如果使用劑量過大，則會對動物和人產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用。1986年開始，歐美等發(fā)達國家已嚴(yán)禁畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用CLB。中國農(nóng)業(yè)部也在1997年3月以[農(nóng)牧發(fā)（1997）3號文]嚴(yán)令禁止β-腎上腺素能激動劑在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用。盡管如此，目前國內(nèi)外非法使用CLB的情況仍非常嚴(yán)重，食用含CLB殘留的肉品中毒事件屢有發(fā)生。造成CLB屢禁不止的原因一方面是經(jīng)濟利益驅(qū)使；另一方面是目前國內(nèi)外檢測CLB的方法、手段還不夠完善，缺乏建立宰前監(jiān)測體系和快速、簡單和精確的檢測方法。下面就目前國內(nèi)外檢測CLB的主要方法及進展情況作一簡單介紹。

1 高效液相色譜法（HPLC）

HPLC適合測定熱不穩(wěn)定和強極性的β-激動劑及其代謝產(chǎn)物，而且，HPLC可以與柱前提取、純化及柱后熒光衍生化反應(yīng)和質(zhì)譜（MS）等系統(tǒng)聯(lián)用，容易實現(xiàn)分析過程的自動化。Liu B.等人于2011年建立了CLB在豬組織中的HPLC-UV檢測方法。豬組織經(jīng)固相萃取后，進一步經(jīng)超聲輔助分散液液微萃取純化，采用HPLC-UV進行檢測，該方法的檢測限為0.07 μg/kg，樣品添加回收率在87.9%～103.6%之間。聶建榮等人建立了以高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）快速檢測動物尿液中的萊克多巴胺和克倫特羅分析方法。樣品經(jīng)SCX柱凈化濃縮后，以乙腈-5mmol/L乙酸銨（65∶35，V/V）為流動相，采用Kromasil CN色譜柱分離，通過電噴霧（ESI）離子源電離多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）對萊克多巴胺和克倫特羅作定性和定量分析。在1.0～500.0 μg/L的范圍內(nèi)線性良好（r＞0.999）。在0.5、4.0、40.0、80.0、200.0 μg/L添加水平下，回收率為89.7%～103.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～7.8%。檢測限（S/N=5）為0.1 μg/L。

因HPLC具有檢測靈敏度高，且檢出假陽性率低等優(yōu)點，目前我國已將HPLC法作為檢測CLB殘留的半確證性方法，該方法的最低檢測限范圍為1～15 ng/g。其缺點是樣品前處理時間長，且處理過程比較繁瑣，需要購買高效液相色譜儀等貴重儀器，操作人員需經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，因此在實際應(yīng)用中受到一定的限制，主要在一些大的研究機構(gòu)和實驗室應(yīng)用。

2 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）

GC-MS法是把色譜高效快速的分離效果和質(zhì)譜高靈敏度的定性分析有機結(jié)合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具有更高的檢測極限。Russo，M. V. 等人于1997年建立了牛尿中CLB殘留的GC-MS檢測方法。樣品經(jīng)固相萃取，C18凈化后經(jīng)GC-MS檢測，該方法的檢測限為0.1 ng/mL。吳銀良等人建立了同時測定動物肝組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺殘留量的GC-MS分析方法。動物肝組織樣品在堿化的條件下用乙酸乙酯和異丙醇混合溶劑提取，經(jīng)SCX固相萃?。⊿PE）柱凈化，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后經(jīng)雙三甲基硅基三氟乙酰氨（BSTFA）衍生后進行檢測。鹽酸克倫特羅和鹽酸萊克多巴胺的檢出限分別為0.30和1.00 μg/kg。

GC-MS與HPLC相比，檢測靈敏度總體來說更高，檢出假陽性率更低。因此，我國將GC-MS法定為檢測CLB的確證性方法（NY/T468-2001）。其缺點與HPLC相似，適用于大的研究結(jié)構(gòu)和實驗室，不能進行現(xiàn)場檢測。

3 毛細管區(qū)帶電泳法（CE）

Anurukvorakun，O.等人于2010年建立了豬肉中同時檢測克倫特羅、萊克多巴胺和叔丁喘寧的多殘留CE方法，該方法對所有分析物的檢測限均為0.3 ng/g。段建平等人建立了同時測定飼料中西馬特羅、鹽酸克倫特羅與沙丁胺醇的毛細管區(qū)帶電泳紫外檢測方法。考察了實驗參數(shù)對分離和檢測結(jié)果的影響。在最佳實驗條件下，在60mmol/L的檸檬酸檸檬酸鈉運行緩沖液（pH6.29）中，上述3種物質(zhì)在8min內(nèi)完全分離。西馬特羅、鹽酸克倫特羅和沙丁胺醇的線性響應(yīng)范圍為0.1～1.0mg/L，最低檢測限（以信噪比為3計）分別為0.02，0.03和0.02 mg/L。

CE法非常適用于那些難以用傳統(tǒng)的液相色譜法分離的離子化樣品的分離和分析，其分離效率可達幾百萬理論塔板數(shù)。與HPLC和GC-MS相比，CE具有操作簡單，色譜柱不受樣品污染，分析速度快，分離效率高，樣品用量少，運行成本低等優(yōu)點，有利于實際樣品的分析。但是毛細管電泳遷移重現(xiàn)性、進樣準(zhǔn)確性以及檢測靈敏度方面相對來說不及HPLC和GC-MS，且缺乏合適的、配套的檢測器，在殘留分析的應(yīng)用中受到一定的限制。

4 免疫分析技術(shù)（IA）

目前，國內(nèi)外用于檢測鹽酸克倫特羅的免疫分析技術(shù)主要有放射免疫分析技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)、滴金免疫技術(shù)及時間分辨熒光免疫分析技術(shù)等。其中，應(yīng)用最廣泛的為酶聯(lián)免疫分析技術(shù)（ELISA）。ELISA的優(yōu)點是特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測迅速，特別適用于大批量樣品的檢測。Ren，X.等人于2009年建立了豬肉和雞肉中CLB殘留的ELISA檢測方法。該方法對2種樣品的檢測限為0.1 ng/mL，平均回收率在81%～102%之間。李平等人用直接競爭ELISA對動物組織中CLB殘留量進行快速篩選檢測。方法將CLB與蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)制備了CLB-BSA和HRP-CLB結(jié)合物，以CLB-BSA免疫實驗兔獲得特異性抗體，并成功建立了CLB殘留直接競爭ELISA檢測方法及檢測試劑盒。檢測線性范圍為0.1～62.5 ng/mL，檢測低限為0.10 ng/mL，尿、肝、肉和飼料的加標(biāo)回收率為60.3%～115.0%。目前，我國進出口檢驗檢疫、獸醫(yī)衛(wèi)生部門及屠宰場多采用德國R-Biopharm和英國Randox等公司生產(chǎn)的CLB-ELISA檢測試劑盒。但由于進口試劑盒價格昂貴，在一定程度上限制了它的使用范圍。國內(nèi)在應(yīng)用ELISA檢測CLB方面的研究起步較晚，早期研發(fā)的ELISA試劑盒普遍存在靈敏度不夠、假陽性率高、不穩(wěn)定等諸多問題，難以推廣應(yīng)用。但隨著技術(shù)的發(fā)展及科研人員的不斷努力，目前國內(nèi)研發(fā)的鹽酸克倫特羅ELISA試劑盒也開始大量投入到商品化生產(chǎn)和實際應(yīng)用中，經(jīng)與同類進口試劑盒進行對比研究，結(jié)果顯示國產(chǎn)試劑盒在靈敏度、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和回收率均接近進口試劑盒水平，且價格上占有很大的優(yōu)勢。

膠體金免疫層析技術(shù)是90年代在免疫滲濾法基礎(chǔ)上建立的一種快速簡單的方法。其關(guān)鍵技術(shù)是抗CLB單克隆抗體的制備、膠體金的制備、金標(biāo)單抗的制備。Zhang G.等人于2006年建立了豬尿中CLB殘留的膠體金檢測方法，其檢測線可達1.0 ng/mL，整個檢測過程在10 min以內(nèi)完成。姜艷彬等人通過研究制成了可檢測出豬尿樣中鹽酸克倫特羅濃度為2 ng/mL的試紙條，結(jié)果可在8 min之內(nèi)進行判斷。綜上所述，試紙條具有操作簡單、快速、檢測時間短，基本不需要任何儀器，對操作人員無專業(yè)要求等優(yōu)點，特別適用于現(xiàn)場大批量樣品的快速篩選。

5 生物傳感技術(shù)

生物傳感技術(shù)是當(dāng)今世界上倍受關(guān)注的一門綜合性很強的技術(shù)領(lǐng)域，是“邁向21世紀(jì)的醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)”之一。該技術(shù)是將生物活性物質(zhì)作為敏感元件（生物識別系統(tǒng)），再配上適當(dāng)?shù)膿Q能器及輸出顯示裝置所構(gòu)成的分析工具，從而成倍的突破了微量檢測的“極限”，大大加快檢測過程，使得全自動無試劑檢測成為可能。國外已有生物傳感器技術(shù)檢測CL殘留的報道。Pizzariello A.等人應(yīng)用分子印記聚合膜（MIP）作為分子識別系統(tǒng)檢測牛肝中CLB殘留。此方法特異性強，缺點是反應(yīng)時間長，靈敏度不高。目前，檢測CLB的生物傳感技術(shù)中，最有發(fā)展前景的是酶免疫傳感技術(shù)。它是酶標(biāo)免疫技術(shù)與光電分析技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的一種電化學(xué)免疫分析技術(shù)。目前酶免疫傳感器的靈敏度可達0.01μg/kg。而且可在幾分鐘之內(nèi)完成檢測全過程。

生物傳感器具有選擇性好、響應(yīng)速度快、樣品用量少、操作簡易、價格低廉、定量準(zhǔn)確，且其結(jié)構(gòu)簡單、體積小、攜帶和使用方便、可以實現(xiàn)連續(xù)的在線檢測和反復(fù)使用等優(yōu)點。

綜上所述，現(xiàn)有鹽酸克倫特羅殘留檢測方法中，HPLC，GC-MS，CE等儀器方法檢測靈敏度高，檢出假陽性率低，但樣品前處理過程繁瑣，需要購買昂貴的儀器設(shè)備，操作人員須經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)，不能實現(xiàn)現(xiàn)場檢測；ELISA作為一種最常用的免疫分析法，具有靈敏度較高，特異性較強，成本低，儀器設(shè)備簡單等特點，但檢出假陽性率較高，只能作為常規(guī)篩選方法。膠體金免疫層析方法和生物傳感技術(shù)靈敏、快速、簡單，可以克服上述方法的缺點，并從定性和定量2個方面實現(xiàn)CLB殘留的現(xiàn)場監(jiān)測，是今后研發(fā)檢測CLB殘留的重要方向。

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，食品安全越來越受到人們的關(guān)注。CLB在食品中的殘留可嚴(yán)重危害人民群眾的身體健康，雖然全國各地每年都開展嚴(yán)厲打擊非法生產(chǎn)、經(jīng)營、使用CLB等藥品的違法犯罪行為，但收效并不理想。消費者熟悉的雙匯集團旗下公司被央視3.15節(jié)目曝光的健美豬真相就是鮮活的例子。因此，研發(fā)CLB簡單、快速、靈敏的檢測方法是大勢所趨，也迫在眉睫。希望能從根本上鏟除“瘦肉精”等違禁藥品的使用，切實保障畜禽產(chǎn)品的質(zhì)量安全，使人民群眾吃上真正的放心肉。