Bevacizumab對(duì)早期糖尿病大鼠血-視網(wǎng)膜屏障破壞的保護(hù)作用

金 燕 劉光耀 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長(zhǎng)春 3004)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的嚴(yán)重眼部并發(fā)癥，血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retina barrier，BRB)破壞是DR的主要病理改變之一，是引起糖尿病黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)的主要原因〔1〕。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是引起視網(wǎng)膜血管滲漏的最主要因子，目前抗VEGF藥物正成為DME治療領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)〔2～4〕。本研究在建立糖尿病大鼠模型的基礎(chǔ)上，觀察抗VEGF單克隆抗體Bevacizumab玻璃體腔注射對(duì)早期糖尿病大鼠BRB功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠40只，體重約250 g，隨機(jī)分為糖尿病模型組(30只)及正常對(duì)照組(10只)。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司)以0.1 mol/L，pH4.2的檸檬酸緩沖液配制成1%的溶液，大鼠禁食12 h后按60 mg/kg腹腔注射STZ，注藥后第3天及第7天測(cè)尾靜脈血糖，血糖≥16.7 mmol/L確認(rèn)糖尿病模型建立，以后每周測(cè)一次血糖、尿糖。正常對(duì)照組腹腔注射0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液。建模2 w的糖尿病大鼠用于實(shí)驗(yàn)，分為糖尿病組(10只)，藥物對(duì)照組(10只)，藥物干預(yù)組(10只)。藥物干預(yù)組玻璃體腔內(nèi)注入25 mg/ml的Bevacizumab 3 μl，藥物對(duì)照組玻璃體腔內(nèi)注入平衡鹽溶液(BSS)3 μl，注藥后1 w，采用溴化乙啶(EB)法測(cè)定BRB破壞程度。

1.2.2 BRB功能的測(cè)定 腹腔注射氯胺酮(90 mg/kg)麻醉大鼠，45 mg/kg EB(Sigma公司)尾靜脈注入，2 h后以1%多聚甲醛檸檬酸緩沖液(0.05 mol/L，pH3.5)經(jīng)心灌注2 min，灌注壓力120 mmHg。灌注結(jié)束后，立即取出眼球，分離視網(wǎng)膜，快速真空干燥5 h后稱干重，加入200 μl甲酰胺(Sigma公司)稱其濕重。在70℃下孵育18 h。然后將提取液在4℃，16 000 r/min下高速離心30 min。取上清液100 μl用分光光度計(jì)(Beckman，DU-640)測(cè)其吸光度(A)值，所用波長(zhǎng)為620 nm和740 nm兩種，凈吸光度值(nA)=A620nm－A740nm。每一樣品測(cè)量3次，取均值。EB的質(zhì)量分?jǐn)?shù)根據(jù)其在甲酰胺中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，用視網(wǎng)膜干重(mg)標(biāo)準(zhǔn)化EB(ng)含量，結(jié)果表示為ng/mg。

2 結(jié)果

正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜標(biāo)準(zhǔn)化EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)值為(11.39±3.71)ng/mg，糖尿病組為(23.83±3.29)ng/mg，明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。藥物干預(yù)組大鼠視網(wǎng)膜標(biāo)準(zhǔn)化EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)值為(15.52±2.74)ng/mg，糖尿病藥物對(duì)照組為(24.15±3.36)ng/mg，兩者相比有顯著性差異(P＜0.01)。

3 討論

DME是引起糖尿病患者視力下降的主要原因之一。DME指糖尿病患者出現(xiàn)黃斑部或危及黃斑部的視網(wǎng)膜增厚或硬性滲出，組織學(xué)上的黃斑水腫是指黃斑區(qū)視網(wǎng)膜內(nèi)的細(xì)胞外液異常積聚，BRB破壞是黃斑水腫的病理基礎(chǔ)〔1〕。EB是一種四鈉重染料，靜脈注射后與血漿白蛋白以10∶1的比例緊密結(jié)合〔5〕。當(dāng)視網(wǎng)膜血管通透性增加時(shí)，這種染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物就滲漏到周圍組織中，用甲酰胺提取組織中的EB，并用視網(wǎng)膜干重標(biāo)準(zhǔn)化所測(cè)得的EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)，是目前公認(rèn)的定量測(cè)量BRB的可靠方法。

DME的治療，包括激光光凝治療、玻璃體手術(shù)治療以及藥物治療〔1，6〕。近年來，對(duì)于傳統(tǒng)的激光光凝和玻璃體手術(shù)治療無效的病例，采用玻璃體腔內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素治療取得了較好的療效，但可能導(dǎo)致青光眼和白內(nèi)障等并發(fā)癥的發(fā)生。研究表明，一部分病人玻璃體腔內(nèi)注入激素后，視力沒有改善。目前抗VEGF藥物正成為治療DME新的研究熱點(diǎn)。在DR發(fā)生、發(fā)展過程中，VEGF是導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管滲漏、黃斑水腫及新生血管生成的重要因子〔2〕。Bevacizumab是一種重組的人類單克隆IgG1抗體，通過抑制VEGF的生物學(xué)活性而起作用，是世界上首個(gè)批準(zhǔn)上市的VEGF抑制劑。目前已將Bevacizumab用于治療老年黃斑變性、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、DME，均取得了較好的療效〔3，4〕。本研究結(jié)果顯示，建模2 w的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜標(biāo)準(zhǔn)化EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)值明顯高于正常對(duì)照組，表明早期糖尿病大鼠出現(xiàn)BRB的破壞。糖尿病大鼠玻璃體腔注入Bevacizumab后1 w，視網(wǎng)膜標(biāo)準(zhǔn)化EB質(zhì)量分?jǐn)?shù)值明顯低于糖尿病藥物對(duì)照組，提示抗VEGF抗體Bevacizumab對(duì)早期糖尿病大鼠BRB破壞有顯著的抑制作用，這種抑制作用可能與視網(wǎng)膜VEGF的表達(dá)明顯下降有關(guān)〔7〕，為早期控制DR的發(fā)展提供了理論依據(jù)。

本研究?jī)H觀察了Bevacizumab注射后1 w對(duì)早期DR的影響，在此基礎(chǔ)上，還需要對(duì)藥效進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的觀察，以及藥物對(duì)不同病程糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的影響，以期對(duì)Bevacizumab療效進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。

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