探討Wnt信號通路與MSCs成骨分化

楊 瑋 徐道華

(廣東醫(yī)學院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

間充質干細胞(mesenchymal cells，MSCs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種易于擴增、具有多種分化潛能的細胞，在不同的誘導條件下，能夠向成骨細胞，成軟骨細胞，成肌細胞、脂肪細胞及基質細胞等不同的細胞系分化〔1〕。MSCs的成骨分化受到多重信號通路的調控，如何定向誘導其成骨分化是解決骨組織工程中種子細胞來源的一個重要前提。近年來的報道稱Wnt經(jīng)典途徑對生理成骨是必需的〔2〕。無論Wnt信號分子的表達增強還是Wnt抑制因子的缺失都將導致骨形成的增強。低密度脂蛋白受體相關蛋白(LPR5)獲得性功能突變會導致高骨量表型，而缺失性功能突變將引起骨質疏松〔2〕。另外骨髓腔內的成骨細胞和脂肪細胞均來源于MSCs，二者具有相同的細胞表型，在一定條件下可以互相轉換，并且存在彼消此長的關系〔3〕。很多轉錄因子，細胞內信號通路調節(jié)兩者的分化。比如，成骨分化主要受runx相關轉錄因子2(runx-2)的控制，而過氧化物酶增殖體激活受體(PPARγ)則是主要的成脂因子〔4〕。

1 Wnt信號通路研究簡介

目前，在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)19種Wnt基因，分別命名為Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等等。它們編碼的 Wnt蛋白分子大約包括350～400個氨基酸〔5〕，且都帶有一段由23～24個半胱氨酸構成的保守區(qū)，這些區(qū)域顯示出20% ～80%的同源性。Wnt蛋白合成后，經(jīng)由糖蛋白修飾，與人卷曲蛋白Fzd結合〔6〕。這一受體家族現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10個成員，分別由500～700個氨基酸組成。Fzd的共受體，即低密度脂蛋白相關受體，LPR5和LPR6是分別含有1 615和1 613個氨基酸的跨膜蛋白。Fzd亦可與單跨膜的酪氨酸激酶樣跨膜受體(ROR2)結合〔7〕。Wnt蛋白與膜受體結合后可導致下游信號的激活，產(chǎn)生不同的生物學作用。這一信號通路包括三條途徑:經(jīng)典 Wnt/β-連環(huán)蛋白(βcatenin)通路、Wnt/Ca2+和Wnt/平面細胞極化(PCP)通路，后兩者又合稱為非經(jīng)典信號途徑。

2 經(jīng)典Wnt信號通路與MSCs成骨分化

2.1 經(jīng)典Wnt信號通路 經(jīng)典信號通路包括一個重要的調節(jié)子β-catenin。當缺乏 Wnt配體時，β-catenin與核心蛋白(Axin)!大腸腺瘤樣蛋白(adenmatous polyposis coli，APC)結合后被酪蛋白激酶 Iα(CKIα)和糖原合成激酶 3β(GSK3β)磷酸化〔8〕，最終被泛素/蛋白激酶途徑降解。這樣一來，β-catenin就無法激活轉錄過程，T細胞因子(TCF)與抑制子組蛋白去乙酰化酶(HDAC)作用，抑制 Wnt靶基因的轉錄〔9〕。

若Wnt蛋白與共受體Fzd，低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP5/6)結合，胞內信號調節(jié)因子(Dvl)將被CKIε磷酸化，LRP5/6-體軸發(fā)育抑制因子(Axin)-FRAT復合物形成后將Axin降解〔10〕，β-catenin就從 APC-Axin-GSK3β 復合物上解離了下來，避免了被分解的命運。這樣一來，積累的β-catenin就會與相關轉錄因子結合，活化Wnt靶基因的轉錄。

2.2 經(jīng)典Wnt信號通路在MSCs成骨分化中的作用 經(jīng)典Wnt信號通路對MSCs成骨分化的促進、抑制作用均見報道。最初有人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典通路共受體LRP5的功能突變引起骨量改變，即LRP5缺失性功能突變導致骨量減少和家族性骨質疏松，而LRP5獲得性功能突變將形成高骨密度表型〔11〕。接著又有β-catenin信號促進了MSCs成骨分化的報道出現(xiàn)〔12〕。后來，在TCF上發(fā)現(xiàn)存在Runx2啟動子的活化激活位點，猜測β-catenin/TCF/LEF復合物可能對Runx2的表達有一定作用〔13〕。

Boland〔14〕與 Boer等〔15〕分別發(fā)現(xiàn)，含有 Wnt3a 的條件培養(yǎng)基或經(jīng)慢病毒轉染W(wǎng)nt3a都將強烈抑制人MSCs成骨分化。外源性的Wnt1也可急劇下調成骨標志物的表達〔15〕，如堿性磷酸酶，骨鈣素等。這一結果與先前發(fā)現(xiàn)的Wnt通路在體內骨動態(tài)平衡中的陽性作用相矛盾。Ross等〔16〕發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路亦可抑制成脂分化。那么，是否在經(jīng)典Wnt通路中，人MSCs更傾向于成骨分化，這仍然是一個有待解決的問題。Liu等〔17〕發(fā)現(xiàn)100 ng/ml Wnt3a可不完全抑制成骨，而在含有25 ng/ml Wnt3 a的培養(yǎng)基中則完全觀察不到堿性磷酸酶(ALP)活性或礦化抑制的現(xiàn)象。相形之下，Wnt3 a抑制成脂分化的能力似乎更強烈一些，5 ng/ml就可達到40%的抑制率，100 ng/ml則可達到完全抑制。在含有Wnt蛋白的雙向(成脂成骨)培養(yǎng)基中，Liu等〔17〕比較了人MSCs成脂成骨的敏感性，結果表明，人MSCs成脂成骨敏感性的不同將改變原有的平衡狀態(tài)，有可能使得人MSCs更傾向于成骨方向分化。Kahler等〔18〕發(fā)現(xiàn)Wnt經(jīng)典通路對成骨的抑制作用歸根結底是β-catenin-Lef復合物對Runx2轉錄活性的抑制。但Gaur等〔13〕在鼠MSCs中又發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin增加了Runx2水平。Liu等〔17〕的結論是高濃度的Wnt蛋白將下調成骨轉錄因子的表達。因此得出結論:體外實驗中，Wnt經(jīng)典途徑對人MSCs的成脂成骨的調節(jié)能力與細胞所處的微環(huán)境中Wnt蛋白的含量有關?？梢钥隙ǖ氖?，通過對Wnt蛋白的適當調節(jié)，可達到控制人MSCs的成脂成骨分化的目的。另外，Wnt蛋白作用下MSCs成脂成骨敏感性的不同，也為一定濃度的Wnt蛋白可抑制MSCs成脂分化，傾向成骨分化提供了依據(jù)。

3 非經(jīng)典Wnt信號通路與MSCs成骨分化

3.1 非經(jīng)典Wnt信號通路簡介 非經(jīng)典Wnt信號通路即βcatenin非依賴途徑，主要作用于細胞的運動和極化過程，包括Wnt/PCP及Wnt/Ca2+通路。Wnt/PCP通路主要包含在個體發(fā)育過程中，包括蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號的激活。這一途徑中的Wnt5a、Wnt11和 Wnt7a與Fzd、ROR2相互作用，并結合散亂蛋白(Dsh)使得Vang、Prickle募集至細胞膜處，通過 Jun、Daam、RhoA、Rac、細胞周期分裂基因(Cdc42)及微絲結合蛋白(Prolin)轉導信號，控制細胞的極化和運動〔18〕。Wnt/Ca2+通路涉及細胞內鈣的釋放，這一途徑中的Wnt蛋白包括Wnt5a，!Wnt11和Wnt4，它們與Fzd受體結合后，活化異源G蛋白，使膜上磷肌醇轉化，將鈣從貯存物中釋放出來〔19〕，隨著細胞內鈣的增加，鈣依賴信號分子比如鈣調蛋白依賴蛋白激酶(CAMKⅡ)和蛋白激酶(PKC)〔19〕將會活化。非經(jīng)典通路中的Wnt5a分子可抑制經(jīng)典 Wnt途徑的活化，這一作用是通過CAMKⅡ激活E3泛素連接酶復合物(Sian)，致使β-catenin的降解來完成的〔13〕。準確區(qū)分Wnt/Ca2+及Wnt/PCP通路比較困難，區(qū)分兩者是通過辨別它們下游的效應分子，Jnk、Rac、Rho歸屬于PCP通路，而鈣及PKC納入Wnt/Ca2+范疇。

3.2 非經(jīng)典Wnt信號通路在MSCs成骨分化中的作用 相比經(jīng)典通路，非經(jīng)典Wnt通路對MSCs分化作用的研究相對較少。據(jù)報道，磷酸化的RhoA和ROCK蛋白對MSCs成骨性分化具有重要作用〔20〕，受體蛋白Ror2的過表達，導致Runx2和Osterix上調，而Ror2反義RNA可抑制MSC成骨分化〔21〕。

Chang等〔22〕發(fā)現(xiàn)Wnt4可增加人類顱面組織分離的MSCs的成骨活性，但Wnt4并不增加細胞內β-catenin的水平，它激活另一新的非經(jīng)典信號通路，即p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)和其他生長因子就是通過p38 MAPK通路誘導MSCs成骨分化。Axin的反義RNA將顯著降低Wnt4誘導的p38活化，表明Wnt4信號通過Axin發(fā)揮作用，而p38抑制劑將阻斷Wnt4激活的MSCs成骨分化。另外，使用不同的顱面骨損傷模型發(fā)現(xiàn)，表達Wnt4的MSCs將顯著更新骨組織，促進顱面部修復。Arnsdorf等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a與MSCs譜系中成骨細胞的命運密切相關。RhoA酪氨酸激酶受體與Wnt5a結合后，激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，誘導Runx2和骨保護素的的表達，但骨鈣素的水平不受影響，這表明Wnt5a可能在干細胞成骨分化的早期階段發(fā)揮作用，但這一過程的完成還需其他因子的參與。

4 展望

Wnt經(jīng)典途徑對人MSCs成骨成脂的調節(jié)與細胞所處的微環(huán)境有關，Wnt4與Wnt5a均可激活成骨活化，但需要其他信號分子才能共同完成整個成骨分化過程。大面積骨損傷修復是一亟待解決的問題，而MSCs在再生醫(yī)學、組織工程及骨形成等方面的臨床應用也是鮮有報道。有研究表明，若給予MSCs聯(lián)丁?；?cAMP(PKA通路的激活劑)，就能使異位成骨從1.5%提高到6%〔24〕。Wnt信號通路的闡明，將揭示MSCs成骨機制，為骨質疏松治療提供新思路。

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