CIK細(xì)胞制備方法的研究進(jìn)展

賀孟來

（湖南長沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219）

隨著腫瘤對人類生存健康的威脅日益嚴(yán)重，應(yīng)對腫瘤的治療模式也發(fā)生著日新月異的變化，各種腫瘤治療的新藥物、新技術(shù)、新方法層出不窮，其中各種腫瘤的免疫細(xì)胞治療非常活躍[1-3]，成為腫瘤生物治療中重要的發(fā)展方向。CIK（Cytokine-Induced Killer）是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療方法的簡稱，是國內(nèi)外繼淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）、腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞（TIL）和CD3McAb激活的殺傷細(xì)胞（CD3AK）之后又一個在國內(nèi)臨床廣泛開展的腫瘤治療方法。1991年，斯坦福大學(xué)的Schmidt-Wolf等[4]首次報道了該細(xì)胞。具體方法是將患者外周血單核細(xì)胞（PBMNC）進(jìn)行分離后，在體外經(jīng)γ干擾素、CD3單抗、白細(xì)胞介素1和白細(xì)胞介素2等細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，具有增殖速度快、殺瘤活性高、非MHC限制、對正常骨髓造血影響輕微等優(yōu)點[5]。

目前CIK細(xì)胞的制備過程基本相同，主要參照美國斯坦福大學(xué)骨髓移植中心建立的CIK細(xì)胞培養(yǎng)方法[6]。第0天加入一定量IFN-γ，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，第1天加入適當(dāng)?shù)腎L-2、CD3單抗和IL-1繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長并根據(jù)情況進(jìn)行擴增。本文總結(jié)了一些培養(yǎng)過程中存在的差異，以期實驗室工作人員從中選擇、借鑒，取長補短，建立一套優(yōu)良的CIK細(xì)胞制備體系，更好服務(wù)于腫瘤細(xì)胞治療的健康發(fā)展。

1 CIK細(xì)胞的來源

目前的實驗研究和臨床應(yīng)用主要以自體外周血來源的CIK細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞，也取得了一些較為明顯的效果[7,8]?，F(xiàn)在CIK細(xì)胞的來源主要有外周血、臍帶血和骨髓。

1.1 自體細(xì)胞

采集患者自體外周血中的單個核細(xì)胞經(jīng)體外擴增后回輸，優(yōu)點是可避免由于交叉感染引發(fā)的疾病，安全性得到極大提高。

1.2 臍血來源細(xì)胞

臍血來源廣泛，輸注臍血來源CIK細(xì)胞不易引嚴(yán)重移植物排斥反應(yīng)，臍血中CIK前體細(xì)胞含量高，易擴增更多的CIK細(xì)胞[9]。王家祥等[10]比較不同來源CIK細(xì)胞體外擴增和殺傷活性時發(fā)現(xiàn)，臍血CIK細(xì)胞體外擴增快，殺傷活性強，對腫瘤細(xì)胞的作用優(yōu)于外周血CIK細(xì)胞。

1.3 骨髓來源細(xì)胞

黃文榮等[11]研究發(fā)現(xiàn)骨髓來源的CIK細(xì)胞增殖能力比外周血來源的CIK細(xì)胞稍差，這可能與骨髓和外周血中免疫細(xì)胞的分化程度及細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的不同有關(guān)?？紤]腫瘤患者放、化療后骨髓的抑制情況，一定程度上限制了骨髓來源CIK細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

1.4 異體細(xì)胞

目前基礎(chǔ)研究常用的CIK細(xì)胞主要來自異體正常供著，來源廣泛，然而在臨床應(yīng)用中可能會增加意外感染的機會[12]。

2 培養(yǎng)基選擇

目前用于CIK細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基包括完全培養(yǎng)基（含10%AB型人血清RPMI1640）和無血清培養(yǎng)基。多數(shù)研究表明，無血清培養(yǎng)基可代替含血清的完全培養(yǎng)基[13,14]。

2.1 完全培養(yǎng)基，因含有人AB型血清，雖經(jīng)HBV、HCV及HIV的檢測，但因“窗口期”的存在或仍有可能傳播其他疾病，安全性不高，并且存在批次差異、不宜質(zhì)控，質(zhì)量不能保證。

2.2 無血清培養(yǎng)基，則可達(dá)到生物潔凈要求，成分明確，質(zhì)量穩(wěn)定，便于質(zhì)控，克服了人AB血清的缺點，能減少患者意外感染的機會，對于免疫治療的推廣應(yīng)用有重要意義。

3 細(xì)胞因子差異

南京大學(xué)附屬醫(yī)院鄒征云等[15]采用從50mL外周血中分離外周血單個核細(xì)胞后，分別應(yīng)用A、B方法進(jìn)行培養(yǎng)。A法應(yīng)用γ-IFN、CD3mAb、IL-2和植物血球凝集素（PHA）行常規(guī)培養(yǎng)；B法在A法的基礎(chǔ)上于培養(yǎng)的第2天，另外加入終濃度為10ng/mL IL-4，1000U/mL的GM-CSF。培養(yǎng)2周發(fā)現(xiàn)，B法可使CIK增殖倍數(shù)明顯提高，最高可達(dá)840倍。結(jié)論是在CIK培養(yǎng)的第2天，增加細(xì)胞因子IL-4和GM-CSF可使CIK得率更高，細(xì)胞總數(shù)＞5×109，從而使得一次性采血50mL制備的CIK足以滿足臨床回輸治療需要。

北京軍區(qū)總醫(yī)院郭智等[16]治療復(fù)發(fā)或難治性淋巴瘤患者采用的CIK細(xì)胞制備方法加入細(xì)胞因子的順序有所不同：培養(yǎng)第1天加入抗人CD3單抗100ng/mL、人重組IL-1α 100U/mL、人重組IFN-γ1000U/mL，第2天加入人重組IL-2 300U/mL，每3天更換培養(yǎng)液并添加人重組IL-2和人重組IFN-γ以維持其濃度，培養(yǎng)12～14d收獲CIK細(xì)胞。

4 培養(yǎng)袋法

常規(guī)CIK細(xì)胞培養(yǎng)是采用大量的培養(yǎng)瓶，工作量大，且容易污染。北京大學(xué)第一醫(yī)院石永進(jìn)等[17]采用1000mL大容量培養(yǎng)袋進(jìn)行自體CIK細(xì)胞大容量培養(yǎng)方法。培養(yǎng)容器采用1000mL大容量培養(yǎng)袋，用一次性注射器進(jìn)行細(xì)胞的定量加樣、取樣，換液時將培養(yǎng)袋在大容量離心機中離心1000rpm 10min，再用分漿夾擠出上清，新配好的培養(yǎng)液經(jīng)輸液管插入培養(yǎng)袋進(jìn)液管后輸入培養(yǎng)袋，密封后放入37℃恒溫培養(yǎng)。結(jié)果表明大容量培養(yǎng)法使自體CIK細(xì)胞擴增總量達(dá)1.6×1010以上，回輸CIK細(xì)胞使患者PBMNC的殺傷活性明顯增加，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。此方法僅使用3～5個1000mL培養(yǎng)袋即可完成常規(guī)方法同樣的工作量，操作更簡便，全封閉的培養(yǎng)操作方式使污染概率大大降低，回輸更安全。

CIK細(xì)胞過繼免疫療法作為一種新的治療手段，實驗室與臨床統(tǒng)一的操作規(guī)程和標(biāo)準(zhǔn)尚未制定，需要探討的問題還有很多。以上方法值得我們借鑒和完善，今后我們將致力于如何用最經(jīng)濟的方法獲得足量高效的免疫活性細(xì)胞，以便在臨床上更推廣應(yīng)用。

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