雞卵黃抗體(IgY)的性質(zhì)、提純及應(yīng)用于寄生蟲學(xué)的研究

周 彥(綜述),沈定文(審閱)

免疫學(xué)IgY技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新的生物技術(shù)領(lǐng)域及醫(yī)藥研究中的熱點(diǎn)技術(shù)。本文簡要綜述雞卵黃抗體(IgY)的特性、提純及應(yīng)用于寄生蟲病免疫診斷及免疫治療等方面,以開拓寄生蟲病防治。

弓形蟲病(toxoplasmosis)危害嚴(yán)重,感染方式多種多樣,常規(guī)檢測方法包括免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測及病原學(xué)檢測等。病原學(xué)培養(yǎng)和動物接種操作復(fù)雜,卻是弓形蟲檢測的金標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)代PCR方法對實(shí)驗(yàn)室條件要求較高且具有經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練的專門技術(shù)人員才可上崗。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法,雖然在區(qū)分現(xiàn)癥和既往感染及診斷免疫缺陷患者方面有缺陷,但其操作簡單,仍然是各實(shí)驗(yàn)室的首選方法。有研究表明[1],IgY可應(yīng)用于弓形蟲病防治且抗體效價高、特異性強(qiáng)、純度高。鑒于此,IgY作為新近研究的免疫診斷抗體是完全可行的,IgY技術(shù)在弓形蟲病防治中越來越受到重視。

1 卵黃抗體(IgY)的性質(zhì)

研究證實(shí)[2],產(chǎn)蛋雞的卵黃對抗體有濃集作用,可使其不斷儲存于卵黃中,這種抗體稱為卵黃抗體(Immunoglobulin of yolk,IgY)。經(jīng)特定抗原免疫后的母雞可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體,進(jìn)而進(jìn)一步應(yīng)用于疾病診斷及防治中。

Wilmar Dias da Silva等[3]報道,IgY與哺乳動物來源抗體相比較在免疫診斷及免疫治療方面具有以下優(yōu)勢:

1.1 產(chǎn)量高 成年母雞血清中IgY大約為5-7mg/mL。一只高產(chǎn)蛋雞每月能產(chǎn)20個雞蛋,每月可獲2g IgY,相當(dāng)于300mL血清中IgY的含量及600mL全血中IgY的含量。生產(chǎn)等量的抗體只能通過大型哺乳動物制得。因此,雞卵黃抗體應(yīng)用于免疫診斷方面更加經(jīng)濟(jì)。使用少量的抗原免疫禽類既可獲得大量的質(zhì)量均一的特異性IgY。

1.2 不發(fā)生交叉血清反應(yīng) 由于種系距離相差很大,禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)。雞來源的免疫試劑比哺乳動物來源的試劑要好而且經(jīng)濟(jì)。

1.3 獲取抗體簡單 IgY無需采血,只需收集免疫母雞產(chǎn)下的雞蛋即可獲得抗體。傳統(tǒng)的哺乳動物來源的抗體搜集需通過繁雜的注射及免疫表達(dá)過程,且需要在常規(guī)間隔時間內(nèi)收集血清。IgY大大簡化了這一流程[4]。

1.4 假陰性或假陽性率低 雞卵黃抗體不激活哺乳動物的補(bǔ)體系統(tǒng),不與細(xì)菌或哺乳動物的Fc受體結(jié)合,不活化樣品中內(nèi)源性的補(bǔ)體系統(tǒng),不與類風(fēng)濕因子或Fc受體相結(jié)合,從而避免在免疫檢測過程中產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果[5]。

1.5 性質(zhì)穩(wěn)定 需冷藏,耐酸,巴氏滅菌溫度下也不會失活并且在pH值小于3時仍能保持穩(wěn)定活性。黃清松[6]等通過ELISA檢測IgY對溫度、酸堿度的穩(wěn)定性,結(jié)果表明IgY具有良好的熱穩(wěn)定性,對酸堿具有一定的耐受力。免疫印跡表明IgY與雞血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性。阮光萍等,用斑點(diǎn) ELISA快速研究雞卵黃抗體 IgY的理化性質(zhì),結(jié)果顯示IgY有很好的耐熱性,巴氏消毒不會使 IgY失活 。卵黃抗體在pH＞5和＜9的環(huán)境下,37oC 3h后仍保持部分活性。卵黃抗體在室溫存放4個月后仍保持部分活性。在pH＜5時,胃蛋白酶能發(fā)揮作用,使卵黃抗體失去活性。

1.6 特殊抗體形成率高 Galtstein和Hemmeler指出,在一個月內(nèi)收集的雞蛋提純IgY產(chǎn)量比兔血清高18倍。因?yàn)镮gY的含量高,產(chǎn)量大,可用于替代兔或羊等動物血清。

2.7 起到預(yù)防及輔助治療的作用 通過口服特異性抗體IgY,作用于病原體,以達(dá)到預(yù)防與治療口腔及消化道感染性疾病的目的,尤其對那些不能產(chǎn)生主動應(yīng)答的個體,如新生兒、有獲得性免疫缺乏癥的兒童、以及由于化學(xué)治療、營養(yǎng)失調(diào)或老年化引起免疫功能下降的人等具有一定的保護(hù)作用。

除此之外,IgY還具有如下性質(zhì):比起從哺乳類動物提取的抗體更加安全衛(wèi)生。對哺乳動物抗原的反應(yīng)度(sensitivity)高。雞免疫7～10d后在雞卵黃中就產(chǎn)生了抗體。能夠迅速應(yīng)對暴發(fā)性疾病(產(chǎn)生特殊抗體)等。

2 IgY提純

2.1 IgY的提取方法 近年來,已建立多種IgY的分離純化方法,包括:水稀釋法(WD)、硫酸銨沉淀法、聚乙二醇法、葡聚糖硫酸鹽法、黃原膠法、冷乙醇分級分離法、水稀釋超濾法等。

G.Bizhanov等比較了葡聚糖藍(lán)法與其他兩種方法(聚乙二醇和氯仿抽提法),結(jié)果顯示這三種方法提取的IgY含量大致在log212.9-14.1,即4.6-12.8 mg/egg。氯仿抽提法獲得的總蛋白含量2-4倍于其他兩種方法。SDS-PAGE顯示,葡聚糖藍(lán)法可見三條主帶(分子量分別為 34.7kDa、41kDa、66kDa)和一條副帶(分子量為45kDa)。用氯仿抽提的IgY可見兩條主帶(分子量分別為45.7kDa、75.2kDa)。用 PEG-6000提取的 IgY可見一條主帶(分子量為66kDa)。

Ismael Marcet[7]等提出了聚乙二醇法(PEG),其卵黃用2倍體積緩沖液稀釋后,采用8.5%、12%PEG兩次沉淀,重新溶解后用 Tris-HCl沉淀,得4.8±0.8mgIgY/mL卵黃。

Cláudia Maria Costa de Almeida 等[8]報道的水稀釋法,稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大,以此作為提取蛋白的一種方法稱水稀釋法[9]。將卵黃用蒸餾水水稀釋10倍后,調(diào)節(jié)pH值至5.5,4℃放置6h以上,可以有效得到WSF(水溶性片段water-soluble fraction)。含IgY的上清液在10 000×g離心30min、經(jīng)飽和硫酸銨純化,IgY產(chǎn)量達(dá)9.8 mg/mL卵黃,回收率達(dá)91%。

任平國等[10]采用的有機(jī)物沉淀法。其原理為:一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶,不溶于水、稀鹽溶液或堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑,它們具有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提脂蛋白的提取液。其工藝流程為:卵黃→8倍水稀釋并攪10min→用HCl調(diào)pH至5.2后在4℃靜置2h去沉淀→在上清液中加入95%冰乙醇(-20℃)使終濃度為60%(v/v)→4℃攪拌20min后離心(22 000r/min,4℃,25min)→收集沉淀并加入0.028mol/LNaCl溶液在4℃下過濾除去脂蛋白沉淀→收集的濾液用SDS-PAGE法進(jìn)行純化得純度為98%的IgY。用大腸桿菌(E.coli)對其活性進(jìn)行測定,效果良好,此方法能保持免疫球蛋白的活性。

2.2 IgY純化方法

主要采用層析技術(shù)。層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異(如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等),使各組分在兩相(一相為固定的,稱為固定相;另一相流過固定相,稱為流動相)中的分布程度不同,從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。最常用的方法為凝膠層析和離子交換層析。

Hamajima[11]用 DEAE-sephacel層析柱純化IgY純度達(dá) 98%,產(chǎn)量為70～100rag/卵。Hansen[12]使用親硫作用層析純化IgY。其原理為:此種親硫?qū)游龅奈絼┲邪?-巰基乙醇與二乙烯砜反應(yīng)的活性支持物,稱為T膠。能在高鹽環(huán)境下選擇性地結(jié)合免疫球蛋白,因而可用于純化IgY。

不少學(xué)者還使用超濾法進(jìn)行IgY純化。其原理為:超濾法使用多孔纖維超濾膜進(jìn)行過濾,這種濾膜只容許小于100kDa的分子通過。IgY的分子量在200kDa左右,因而不能通過被留下。Akita在多次沉淀WSF后使用超濾法,Ntakarutimana在使用親和層析提取IgY后再利用超濾膜過濾,均起到進(jìn)一步純化IgY的作用。

Dexian Dong[13]等,為尋找最適配體,用按照最大區(qū)分度配體標(biāo)準(zhǔn)的選擇出來的240柱配體連接膠體去粘合IgY。每組實(shí)驗(yàn)包括24配體聚苯乙烯柱。使用此配體的IgY純度可達(dá)92.1%,回收率可達(dá)78.2%。

3 IgY應(yīng)用前景

3.1 疾病免疫診斷 Kerstin Greunke[14]等報道,IgY可作為檢測或捕獲抗體檢測傳統(tǒng)的哺乳動物免疫球蛋白,具有更高的靈敏性和精確性。施強(qiáng),李婷婷報道,用IgY作為第I抗體,間接酶免疫染色,檢查細(xì)胞內(nèi)弓形蟲速殖子,具有特異性。沈榮等報道,用純化的弓形蟲蟲體抗原免疫白萊杭雞獲得特異性的IgY抗體,以辣根過氧化物酶標(biāo)記后與抗人IgM單抗配伍建立捕獲法酶免疫試驗(yàn),與同類試劑對照,平行檢測192份臨床樣本,檢測結(jié)果二者吻合。

3.2 疾病治療 李慶昌等報道,從人胃低分化粘液腺癌細(xì)胞MGC803中分離出一種癌蛋白P110,并以此蛋白P110為抗原免疫產(chǎn)蛋母雞,再從免疫過的雞蛋卵黃中分離出對人低分化粘液腺癌細(xì)胞具有選擇性識別作用的抗體IgY,再與蓖麻毒蛋白的A鏈偶聯(lián)成IgY-RicinA免疫毒(生物導(dǎo)彈),并對體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞具有選擇性和殺傷能力。結(jié)果顯示:用IgY-RicinA免疫毒治療TA小鼠S-78-4腫瘤獲得較好的效果,治愈率達(dá)84%。臨床應(yīng)用IgY-RicinA治療上消化道中晚期惡性腫瘤30例,有效率達(dá)79.9%,治療前后肝腎功能及血象檢查無異常變化,而且治療后未發(fā)現(xiàn)毒副反應(yīng)。生物導(dǎo)彈IgY-RicinA治療上消化道腫瘤有一定的作用,是一種很有發(fā)展前途的制劑。

Chao-Yang Fu[15]等報道,使用水純化法制得抗SARS冠狀病毒的IgY,經(jīng)G-75柱進(jìn)一步純化之后,制得的 IgY有較高的純度,再經(jīng)SDS-PAGE、western blot分析,其反應(yīng)活性效價為1∶640。凍干法和穩(wěn)定性測試顯示,抗SARS冠狀病毒IgY具有很有發(fā)展前途的物理特性,反應(yīng)活性不減低,有較好的化學(xué)穩(wěn)定性。所有數(shù)據(jù)表明,抗SARS冠狀病毒的IgY可以作為特定的抗病毒治療SARS的一種新興生物制品。

3.3 發(fā)現(xiàn)藥物靶點(diǎn) Wei-Wei Zhang報道,IgY是一類免疫球蛋白,與常規(guī)使用的 IgG相比更具特點(diǎn)。特定基因型的IgY抗體能夠應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)及檢測生物芯片中的藥物靶點(diǎn)。

3.4 食品檢測 Zhao-Hui DUAN[16]等報道,SDSPAGE顯示抗桔霉素IgY純度較高且分子量在1000KD左右。間接ELISA顯示,IgY用于檢測桔霉素的閾濃度為 10ng·mL-1,在20～640 ng·mL-1有很好的線性關(guān)系。

Chao-Cheng Chen[17]等報道,通過大腿肌內(nèi)注射雞獲得抗牛奶堿性磷酸酶的免疫球蛋白IgY,并把這種抗體作為引導(dǎo)競爭性間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(CI-ELISA)檢測奶粉(BM)及大腸桿菌來源的奶粉堿性磷酸酶(BMALP)的一抗。CI-ELISA證實(shí)此法能夠有效區(qū)分奶粉堿性磷酸酶及結(jié)腸堿性磷酸酶,并對全脂奶粉及脫脂奶粉的結(jié)腸堿性磷酸酶的活性為0.6U/mL的情況下進(jìn)行定量。

3.5 其他

3.5.1 乳牙防齲:王祝玲,王強(qiáng)[18]報道,應(yīng)用抗齲IgY牙膏6個月后,實(shí)驗(yàn)組、對照組間發(fā)病率、新增齲均、新增齲面均無顯著性差異(P＞0.05);1年后,實(shí)驗(yàn)組與對照組間新增齲均、新增齲面均有顯著性差異(P＜0.05);18個月后實(shí)驗(yàn)組與對照組間的發(fā)病率、新增齲均和新增齲面均有顯著性或極為顯著性差異(P＜0.01),實(shí)驗(yàn)組明顯低于對照組?？过xIgY牙膏的應(yīng)用能降低乳牙齲病的發(fā)病率及新增齲均、齲面均具有一定的防齲效果,有較好的應(yīng)用前景。

3.5.2 抗病毒:Peter T.Witkowski[19]等報道,由于從雞蛋收集的抗體可產(chǎn)生大量非侵略性抗體。為減少其攻擊性,使用原始形態(tài)的蛋白免疫來逃避先前的蛋白表達(dá)和純化。用DNA表達(dá)載體免疫雞,收集雞蛋并提純制得抗痘病毒的IgY。

3.5.3 抗細(xì)菌:張文平等報道,分離人陰道上皮細(xì)胞,用抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌對陰道上皮細(xì)胞預(yù)處理后進(jìn)行白色念珠菌黏附抑制試驗(yàn);建立小鼠白色念珠菌性陰道炎模型,通過陰道局部給抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌來觀察療效。結(jié)果顯示,抗白色念珠菌IgY和乳酸桿菌均能抑制白色念珠菌黏附陰道上皮細(xì)胞,并能減少白色念珠菌在小鼠陰道內(nèi)的定植和減輕小鼠陰道局部的炎癥反應(yīng)。

3.5.4 抗生育:精子具有免疫原性在一個世紀(jì)以前已為人所知,某些特異性抗體與精子抗原結(jié)合可影響精子的運(yùn)動或獲能、干擾精卵結(jié)合等從而引起不育也為人所證實(shí),故這些抗精子抗體具有開發(fā)成避孕藥具的潛在可能[20]。呂年青等用人全精子抗原來免疫產(chǎn)蛋母雞,從卵黃中獲得了大量特異性的抗人精子IgY,并發(fā)現(xiàn)這些抗精子IgY可以使人類精子凝聚,提示抗精子IgY有可能成為未來極有潛力的候選避孕藥具。

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