抗菌肽SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)策略

陳琛，吳三橋，李新生，張小鶯，閆茂倉(cāng)

1 陜西理工學(xué)院 陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漢中 723000

2 西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

3 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，溫州 325005

植物、動(dòng)物等生物體生長(zhǎng)在充滿各種微生物的環(huán)境中，隨時(shí)面臨環(huán)境中病原微生物的挑戰(zhàn)，抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP) 是生物機(jī)體在抵御病原性微生物時(shí)產(chǎn)生的一類防御性小肽，是生物免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分[1-3]。自從Boman首次從昆蟲中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗菌肽天蠶素 (Cecropin) 以來(lái)，目前已經(jīng)從昆蟲、哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、植物、細(xì)菌、海洋生物等中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽大約有1 598種[4-6]。綿羊骨髓細(xì)胞抗菌肽SMAP-29 (Sheep myeloid antibacterial peptides with 29 amino acids)，是由意大利Bagella和美國(guó) Mahoney兩個(gè)不同的研究小組于 1995年同時(shí)發(fā)現(xiàn)[7-8]，是從綿羊Cathelicidins前體蛋白的C端截取的含29個(gè)氨基酸殘基的Cathelicidin類抗菌肽，分子量為3.2 kDa。Mahoney等[8]首先化學(xué)合成并且檢測(cè)了它的生物活性。SMAP-29具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌，抗真菌，抗衣原體、螺旋體，抗病毒，抗內(nèi)毒素活性，是一種非常有開發(fā)應(yīng)用潛力的抗感染肽[9-10]。

研究者基于SMAP-29的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了許多新的類SMAP-29抗菌肽，如Ovispirin-1、Novispirin G-10、Novispirin T-7和Novicidin等，目前SMAP-29抗菌肽家族共有30個(gè)成員。近年來(lái)出現(xiàn)了大量SMAP-29及SMAP-29家族抗菌肽的研究報(bào)道，且呈上升趨勢(shì)。本文綜述了 SMAP-29抗菌肽家族的基因和蛋白結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、生物功能，重點(diǎn)闡述了 SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)的必要性和基于 SMAP-29一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)策略，為 SMAP-29藥物設(shè)計(jì)和研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 SMAP-29家族抗菌肽的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系

1.1 SMAP-29家族抗菌肽結(jié)構(gòu)

抗菌肽 SMAP-29基因結(jié)構(gòu)：其前體是由567 bp組成的一條編碼 160個(gè)氨基酸殘基的Cathelicidins基因片段，具有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子(圖 2A)[11]。第1個(gè)外顯子編碼信號(hào)肽的 29個(gè)氨基酸殘基和前導(dǎo)肽 (Pro) 的部分序列，外顯子2、3編碼Cathelin蛋白信息，外顯子4編碼Cathelin的剩余序列和SMAP-29的成熟肽。在信號(hào)肽和Pro之間有一個(gè)信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)，可以被信號(hào)肽酶識(shí)別從而切除信號(hào)肽。Pro和SMAP-29成熟肽之間還有一個(gè)胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，在蛋白酶的作用下，Cathelicidins前體變?yōu)槌墒祀?，再釋放到?xì)胞外發(fā)揮生物學(xué)功能。另外，整個(gè)基因結(jié)構(gòu)中有 EcoRⅠ、PstⅠB等多個(gè)酶切位點(diǎn)，顯示了多種限制性片段多態(tài)性。

SMAP-29蛋白結(jié)構(gòu)：SMAP-29一級(jí)結(jié)構(gòu)包括29個(gè)氨基酸，分子量為3 256 Da，序列中富含精氨酸 (Arg)、甘氨酸 (Gly) 兩種氨基酸殘基，29個(gè)氨基酸中共有6個(gè)Arg和5個(gè)Gly。其余氨基酸殘基分別為：亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸和絲氨酸。經(jīng)圓二光譜分析和X線晶體衍射實(shí)驗(yàn)證明，抗菌肽SMAP-29在水相中呈無(wú)規(guī)則卷曲狀態(tài)，但在含有SDS的水溶液中以α-螺旋形式存在，α-螺旋的N端起抗菌作用。在類脂質(zhì)環(huán)境中 8~17位氨基酸形成一個(gè)兩親性 α-螺旋結(jié)構(gòu)，18~19位的脯氨酸呈中心鉸鏈區(qū)、20~28位的氨基酸形成SMAP-29抗菌肽的疏水片段，起溶血作用[12]。SMAP-29凈電荷為+10。

目前已知的 SMAP-29家族成員的氨基酸序列見表1。Ovispirin-1是從SMAP-29的N端截取的含有 18個(gè)氨基酸的 α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽。將Ovispirin-1中的第10 位的異亮氨酸 (Ile) 用甘氨酸替代后篩選了具有抗菌活性的 Novispirin G-10； Novispirin G-10的第7 位Ile被蘇氨酸 (Thr) 替代后的抗菌肽命名為 Novispirin T-7；Novicidin是在Novispirin G-10的C端的Gly18→Phe。Sawai等[13]通過(guò)圓二光譜分析 (CD) 和核磁共振 (NMR) 研究表明Ovispirin-1、Novispirin G-10和Novispirin T-7在三氟乙醇 (TFE) 溶液中呈兩親性螺旋結(jié)構(gòu)(見圖2C)。Novicidin也是一個(gè)線性陽(yáng)離子α-螺旋抗菌肽。

表1 SMAP-29家族抗菌肽的氨基酸序列Table 1 Amino acid sequences of SMAP-29 and variants

圖1 SMAP-29和同系物的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of SMAP-29 and variants. (A) Gene structrus of SMAP-29. (B) Structure of SMAP-29 in solution[12]. (C) Structures of the three peptides[13].

1.2 SMAP-29的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系

SMAP-29分子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系已經(jīng)開展過(guò)很多研究，基于SMAP-29的基本結(jié)構(gòu)，通過(guò)從末端去除氨基酸合成不同長(zhǎng)度的類似物，以研究SMAP-29序列中起主要抗菌活性的氨基酸。Shin等[14]人工合成了幾種SMAP-29類似物，并檢測(cè)了它們的抗菌活性。與天然的SMAP-29相比，SMAP-29 (1-17) 和 22位、25位、27位賴氨酸 (K22,25,27) 替換了的 SMAP-29具有相對(duì)有效的抗菌活性 (MIC: 1.0~8.0 μmol/L)，并且這2種類似物完全失去了溶血活性，而發(fā)生在 19 位 Ala替代 Pro的變化使SMAP-29的抗菌活性大大降低。說(shuō)明 SMAP-29的N-端兩親性α-螺旋區(qū)與抗菌活性密切相關(guān)，C-端疏水區(qū)與溶血性有關(guān)，而位于中心的19位的Pro對(duì)增強(qiáng)抗菌活性有很重要的作用。特別是[K2,7,13]-SMAP-29(1-17) 在高鹽環(huán)境下表現(xiàn)很高的抗菌活性，同時(shí)也失去了溶血活性。因此，這種短肽被認(rèn)為是誘人的抗菌藥物的候選者之一。SMAP-29是一個(gè) α-螺旋彎曲或折疊延伸構(gòu)型，在水相緩沖液中以無(wú)序的結(jié)構(gòu)存在，而在類膜環(huán)境中高度螺旋。用全長(zhǎng)的和截短了的SMAP-29分子實(shí)驗(yàn)揭示：全肽包含2個(gè)LPS結(jié)合區(qū)，N-端的LPS結(jié)合域 (RGLRRLGR)比 C-端的 LPS結(jié)合域的結(jié)合 LPS效力更高。LPS與截短了的混合肽的結(jié)合試驗(yàn)表明這種協(xié)同主要是發(fā)生于分子內(nèi) (如：含有N-和C-端LPS結(jié)合位點(diǎn)的同一種小肽分子)。推斷有協(xié)同功能的多識(shí)別位點(diǎn)的出現(xiàn)使得SMAP-29可以和LPS高親和性結(jié)合。

根據(jù)結(jié)構(gòu)研究證明 α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì) SMAP-29的抗菌活性起到至關(guān)重要的作用。但是，這不是唯一的決定因素，可能與以下因素也有關(guān)：1) 抗菌活性與肽本身的凈電荷有關(guān)；2) 抗菌活性與沿螺旋軸的疏水性程度有關(guān)；3) 抗菌活性與序列中陽(yáng)離子氨基酸殘基的百分比有關(guān)。

2 SMAP-29家族抗菌肽的作用機(jī)制

抗菌肽都是陽(yáng)離子型的或兩親性的，這一特征決定了它們的抗菌作用模式，肽的陽(yáng)離子部分與微生物膜的陰離子相互作用，并最終導(dǎo)致微生物膜的透化?？咕呐c膜的作用方式主要有以下幾種[15]：桶板模型 (Barrel-stave model)、環(huán)孔模型 (Toroidalpore model) 和地毯模型 (Carpet model) 等 (圖2)。

SMAP-29是以穿孔方式作用于細(xì)胞的，但是以何種穿孔方式通過(guò)細(xì)胞膜尚無(wú)定論。在掃描電鏡下SMAP-29可以迅速引起大腸桿菌和銅綠假單胞菌外膜表面發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，形成大量的水泡樣物質(zhì)。免疫電鏡下 SMAP-29能在瞬間穿透大腸桿菌細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。Lee等[16]對(duì)其類似物的作用機(jī)制的研究也證明了這一點(diǎn)。Orlov等認(rèn)為SMAP-29可以穿透各種細(xì)胞膜，使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜和外膜極化或去極化，迅速誘導(dǎo)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌中的大量鉀離子外流[17]。Alessandra等用掃描電鏡研究SMAP-29的殺菌機(jī)理，認(rèn)為其主要機(jī)理是破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，直接通過(guò)磷脂雙分子層，形成能量和鹽離子依賴性通道，致使離子和其他物質(zhì)外流，最終達(dá)到殺菌的目的[18]。

Nielsen利用CD、石英晶體微天平 (QCM-D)、雙偏振干涉測(cè)量 (DPI) 和熒光分析法研究了Novicidin的作用機(jī)制，結(jié)果表明 Novicidin是地毯模式整合到細(xì)胞膜上而起到殺死細(xì)菌的作用[19]。作用步驟是α-螺旋的Novicidin首先以“地毯”模式聚集在細(xì)胞膜上，聚集到一定數(shù)量后瞬間產(chǎn)生大的孔洞，然后更多抗菌肽分子的加入，環(huán)繞著菌體切斷胞膜，使細(xì)菌從中部斷開，使細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)泄露而殺死細(xì)菌[20]。

圖2 抗菌肽的作用機(jī)制 (棒狀代表抗菌肽，灰色疏水區(qū)，白色親水區(qū))[21]Fig. 2 Mechanism of action of antibacterial peptides[21]. The cylinders represent antimicrobial peptides, hydrophobic areas are gray, and hydrophilicareas are white. (A) Barrel-stave pore model. (B) Thoroidal pore model. (C) Carpet model.

3 SMAP-29家族抗菌肽生物功能

3.1 抗細(xì)菌活性

SMAP-29是一個(gè)廣譜、具有潛在開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的抗菌肽，對(duì)多種G+、G?細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大腸桿菌Escherichia coli、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae、 脆 弱 類 桿 菌 群 細(xì) 菌Bacteroides fragilis group、梭菌綱 (Clostridia) 中的產(chǎn)氣莢膜梭菌 Clostridium perfringens、難辨梭菌Clostridium difficile等標(biāo)準(zhǔn)株和 100種臨床分離的G+何G?均有很好的抑菌效果，SMAP-29最小抑菌濃度 (Minimum inhibitory concentration，MIC) 可達(dá)到0.09 μmol/L。對(duì)一些口腔疾病性細(xì)菌、肺炎疾病臨床性分離菌都有較好的抗菌活性，各種細(xì)菌的抗菌譜具體見表2。

SMAP-29能快速殺死病原體，在 1~2 h內(nèi)SMAP-29能完全的殺死病原體，而不是僅僅抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。0.3~3 μmol/L濃度的SMAP-29在幾分鐘就能快速殺滅甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌。為了證明其殺菌活性及機(jī)制，用透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡研究表明抗菌肽可誘導(dǎo) S. aureus細(xì)胞裂解，胞漿內(nèi)容物外泄，菌體破裂導(dǎo)致死亡，能快速導(dǎo)致大量的細(xì)菌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷。SMAP-28也能快速有效殺滅細(xì)菌，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)和存活率實(shí)驗(yàn)表明在4 mg/mL (1.2 mmol/L) 濃度下，在5 min內(nèi)就能殺滅60%細(xì)菌數(shù)量，其家族的Ovispirin-1、Novispirin G-10、Novispirin T-7和Novicidin都具有較好的抗菌活性[22]。

3.2 抗真菌活性

真菌是具有真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物，它可引起動(dòng)植物的多種病害，不僅影響農(nóng)作物產(chǎn)量、動(dòng)物生長(zhǎng)，而且影響人體健康，威脅人類生命安全，抗真菌藥物開發(fā)是真菌研究方面的一個(gè)重要課題。Benincasa等[23]系統(tǒng)研究了 SMAP-29、BMAP-27、BMAP-28、Protegrin-1 (PG-1) 和Indolicidin 5種抗菌肽對(duì)70多種臨床分離株的抗真菌活性，均有一定的抗菌活性，MIC值在0.5~32 μmol/L之間。

表2 SMAP-29的抗菌活性Table 2 Antimicrobial activity of SMAP-29

續(xù)表2

3.3 抗螺旋體、衣原體活性

Vittorio等發(fā)現(xiàn)SMAP-29對(duì)鉤端螺旋體Leptospira interrogan和密螺旋體 Treponemainterrogan抗菌效果較強(qiáng) (MIC分別為3.84 μmol/L和9.72 μmol/L)，而對(duì)包柔螺旋體 Borrelia interrogan的 MIC為61.2 μmol/L[34]。Donati等比較了Bac7、SMAP-29、BMAP-27、BMAP-28、PG-1和 LL-37等 6種Cathelicidin家族抗菌肽的抗衣原體活性，結(jié)果顯示SMAP-29抗沙眼衣原體 Chlamydia trachomatis和肺炎衣原體Chlamydia pneumoniae活性最強(qiáng) (MIC僅為 3 μmol/L)[35]，其余 5種抗菌肽 MIC濃度達(dá)25 μmol/L時(shí)也不表現(xiàn)抗衣原體活性。

3.4 抗內(nèi)毒素活性

內(nèi)毒素是G?細(xì)菌死亡時(shí)裂解出來(lái)的細(xì)胞壁脂多糖 (LPS) 成分。LPS的基本結(jié)構(gòu)由O抗原、核心多糖和類脂A (lipid A) 三部分組成，其中類脂A是內(nèi)毒素的生物學(xué)活性主要毒性成分?？咕牡亩嗑坳?yáng)離子能與LPS上的陰性磷酸鹽離子結(jié)合，從而競(jìng)爭(zhēng)性地抑制脂多糖結(jié)合蛋白 (LBP) 與 LPS結(jié)合，導(dǎo)致游離LPS不能得以轉(zhuǎn)運(yùn)，使其刺激信號(hào)不能得以傳遞?？咕倪€能抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的前炎癥基因表達(dá)，阻止分泌型蛋白炎癥介質(zhì)，如抑制腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 和內(nèi)毒素誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)位的核因子-κB (NF-κB) 亞單位的分泌，卻產(chǎn)生和釋放出多種趨化因子來(lái)維持其他前炎癥應(yīng)答，以達(dá)到選擇性抑制前炎癥應(yīng)答作用，預(yù)防內(nèi)毒素血癥。

SAMP-29在多微生物引起的盲腸結(jié)扎敗血癥中，可減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和降低體內(nèi)LPS的循環(huán)水平。Tack等研究表明SMAP-29具有2個(gè)LPS結(jié)合位點(diǎn)和 1 個(gè)鉸鏈區(qū)[12]。Bartlett等[36]報(bào)道SMAP-29、Ovispirins和Novispirins具有LPS結(jié)合能力，體外測(cè)定了SAMP-29中和內(nèi)毒素的能力，半數(shù)有效濃度 (Median effective concentration values，EC50) 為3.3 μmol/L。Giacometti等[37]以2種小鼠內(nèi)毒素休克模型和 CD14+的小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW 264.7研究了SMAP-29抗內(nèi)毒機(jī)制，大鼠腹腔注射E. coli 0111:B4 LPS，然后分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，給1 mg/kg 多粘菌素B (Polymyxin B)、0.9%氯化鈉、1 mg/kg SMAP-29和20 mg/kg亞胺培南，測(cè)定血漿中的內(nèi)毒素、TNF-α-濃度，結(jié)果顯示SMAP-29能顯著降低血漿中的內(nèi)毒素和TNF-α濃度，SMAP-29與Polymyxin B無(wú)顯著差異。由于SMAP-29具有雙倍的抗內(nèi)毒素的能力，所以有望開發(fā)為預(yù)防內(nèi)毒素血癥的藥物。

SMAP-28可與 P. aeruginosa、Burkholderia cepacia和K. pneumoniae細(xì)菌分泌莢膜多糖相互作用。盡管SMAP-28具有一定的LPS結(jié)合能力，但是在SMAP-28≤20 μmol/L時(shí)不能抑制LPS誘導(dǎo)表達(dá)的 3個(gè)前炎因子基因 (白細(xì)胞介素-1B基因、CCL-2/MCP-1和CCL-3/MIP-1a)。

3.5 抗寄生蟲活性

Giacometti等[38]研究了濃度為 100、10 μg/mL的4種抗菌肽 (SMAP-29、BMAP-28、PG-1和Bac7)與隱孢子蟲 Cryptosporidium parvum孢子體和卵囊在37 ℃分別作用0、5、10、15、20、30、40、50、60、120和180 min，結(jié)果SMAP-29顯示了最高的抗隱孢子蟲孢子體活性，10 min后完全抑制了隱孢子蟲孢子體活力。3 h后觀察對(duì)卵囊的抑制，發(fā)現(xiàn)SMAP-29抑制率為40%，較其他3種抗菌肽的抑制率高。

3.6 抗囊性纖維化病病原體

囊性纖維化病 (Cystic fibrosis，CF) 是歐美高加索人種中最普遍的致死性遺傳病。CF是由于氯離子通道蛋白基因的突變?cè)斐傻?，造成分泌黏液厚度增加，容易引起呼吸道的二次感染，這種感染是由幾種細(xì)菌引起的，其中一種是銅綠假單胞菌，能夠感染全部的 CF患者。Saiman等[32]研究了 5種cathelicidin抗菌肽 (LL37、CAP18、mCRAMP、rCRAMP和SMAP29) 和3種α-螺旋抗菌肽OV-1、OV-2和OV-3對(duì)從CF患者臨床分離的39株多耐藥病原體抗菌活性，SMAP-29對(duì)CF患者多耐藥病原體的抗菌活性最好，MIC為0.06~8 μg/mL，而人源抗菌肽LL-37的MIC則是1.0~32 μg/mL。

4 SMAP-29的結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)

許多抗菌肽具有一定的細(xì)胞毒性、溶血性、生理?xiàng)l件下穩(wěn)定性差和化學(xué)合成成本極高等缺點(diǎn)，制約了其開發(fā)和臨床應(yīng)用，到目前僅有極個(gè)別抗菌肽藥物進(jìn)入 III期臨床試驗(yàn)。為此就要開展 SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)，這是SMAP-29走向臨床研究開發(fā)的必經(jīng)之路，也是未來(lái)SMAP-29類抗菌肽研究的發(fā)展方向。

4.1 開展SMAP-29分子設(shè)計(jì)的必要性

4.1.1 SMAP-29的高毒性和溶血性

許多抗菌肽具有較高的細(xì)胞毒性和溶血性，Cathelicidins類抗菌肽也毫不例外。SMAP-29的 N端疏水性氨基酸與雙親性的真核細(xì)胞外膜可通過(guò)疏水相互作用而結(jié)合。推測(cè)SMAP-29對(duì)真核細(xì)胞的溶解作用與其抗菌機(jī)制相似，都是通過(guò)SMAP-29在細(xì)胞表面發(fā)生去垢劑樣作用而破壞細(xì)胞膜的完整性。SMAP-29對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶血性較高，50 μmol/L時(shí)為7.9%。Xiao等研究表明SMAP-29對(duì)狗腎細(xì)胞(MDCK)具有細(xì)胞毒性[39]。

SMAP-28對(duì)人紅細(xì)胞具有很高的溶血性，當(dāng)肽濃度為4、20、100 μmol/L時(shí)溶解率分別達(dá)到4%、20%和61%~100%，但是對(duì)綿羊紅細(xì)胞的溶解率相對(duì)較低，80 μmol/L時(shí)為3%?？咕娜苎钚钥赡艹霈F(xiàn)在以下幾種情況中：高疏水性的環(huán)境、極性角度相對(duì)狹窄和存在高度輸水區(qū)。

4.1.2 協(xié)同效應(yīng)

協(xié)同效應(yīng)對(duì)臨床藥物開發(fā)非常重要。有極個(gè)別的研究證明幾個(gè)抗菌肽和其他的抗菌肽具有一定的協(xié)同效應(yīng)，但是關(guān)于SMAP-29的協(xié)調(diào)效應(yīng)方面的研究較少，Saiman等[32]研究了 SMAP-29與傳統(tǒng)抗生素聯(lián)合使用沒有明顯的協(xié)同效應(yīng)。牛明福等[40]報(bào)道有4個(gè)融合蛋白 (包括SMAP-29) 當(dāng)在畢赤酵母中表達(dá)的時(shí)候表現(xiàn)出與鏈霉素和多粘菌素B有一定的協(xié)同效應(yīng)。也有報(bào)道 SMAP-28和溶菌酶和牛Lactoferrin聯(lián)合在抗大腸桿菌時(shí)具有協(xié)同效應(yīng)，其他更多的關(guān)于 SMAP-29的協(xié)同效應(yīng)的知識(shí)目前知之甚少。

4.1.3 穩(wěn)定性

許多研究者[14,25,33,38]均發(fā)現(xiàn)抗菌肽在沒有鹽離子的情況下能快速殺滅病原微生物，但是在生理?xiàng)l件下或鹽離子濃度存在的溶液中抗菌活性大大下降，甚至有一些抗菌肽，如α、β-defensins和OaBac5，鹽離子濃度達(dá)到100 mmol/L時(shí)就會(huì)迅速失去作用效果。Shin等[14]研究表明SMAP-29在未加鹽的環(huán)境中抗B. subtilis的MIC為2.0，若在0.1 mol/L NaCl存在的溶液中抗B. subtilis的MIC變?yōu)槲醇欲}的 2倍?？咕囊患?jí)結(jié)構(gòu)中由于含有多個(gè)堿性氨基酸殘基 (如Lys、Arg) 而容易被胰蛋白酶水解。

4.1.4 SMAP-29化學(xué)合成成本

與傳統(tǒng)抗生素相比多肽的化學(xué)成本昂貴，合成0.1 g SMAP-29純品需要12 000~17 000元，高成本限制了多肽藥物開發(fā)研究。氨基酸殘基的多少?zèng)Q定著合成的難度和成本，氨基酸殘基較少的短肽合成成本較低，經(jīng)過(guò)分子設(shè)計(jì)截短的抗菌肽勢(shì)必會(huì)降低生產(chǎn)成本。

4.2 SMAP-29結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)

抗菌肽分子設(shè)計(jì)是基于結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，通過(guò)一系列生物信息學(xué)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)天然抗菌肽的定向改造或全新設(shè)計(jì)，獲得更加符合人類需要的非天然序列，并闡明抗菌肽的活性機(jī)制，供進(jìn)一步開發(fā)利用[41]。SMAP-29是α-螺旋結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子抗菌肽，在分子設(shè)計(jì)上要遵循以下幾個(gè)基本原則：

1) 陽(yáng)離子性。陽(yáng)離子性決定其能否選擇性地與帶負(fù)電性的細(xì)菌細(xì)胞膜外表面相互吸引，而不與呈中性的真核生物細(xì)胞膜外表面產(chǎn)生相互作用，這也就是它們對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有毒副作用的主要原因。

2) 兩親性。兩親性決定其能否有效插入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，形成疏水通道。

3) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化原則。在保證抗菌活性前提下，應(yīng)盡量簡(jiǎn)化抗菌肽的序列和結(jié)構(gòu)，這樣易于進(jìn)行化學(xué)合成，也有助于闡明單一因素改變對(duì)活性的影響。

4.2.1 基于SMAP-29一級(jí)結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)

殘基替換：就是替換天然序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，是結(jié)構(gòu)功能研究最有效和常用的方法，在克服天然肽鏈的毒性問題上，往往起到理想的效果。對(duì)SMAP-29抗菌肽進(jìn)行殘基替換設(shè)計(jì)了一系列新的抗菌肽，如SMAP-29[A19]、SMAP-29[K22,25,27]、SMAP-29 [1?17，K2,7,13]和Novispirin G-10等。Shin等[14]將SMAP-29中的Pro19→Ala后發(fā)現(xiàn)活性降低，SMAP-29序列中Leu22，Ile25，Ile27→Lys(K) 替換，SMAP-29[1-17]中的3個(gè)氨基酸也被Lys替換，替換后產(chǎn)生的 SMAP-29[K22,25,27]和 SMAP-29[1?17，K2,7,13]對(duì)細(xì)胞的毒性降低，在100 μmol/L肽濃度條件下對(duì)人紅細(xì)胞溶血性為 0%。替換后新肽SMAP-29[K22,25,27]的抗 C. albicans菌活性沒有發(fā)生變化，但是抗M. luteus、S. aureus、S. epidermidis等的活性降低 2~4倍。Sawai等[13]在保留兩親螺旋結(jié)構(gòu)的前提下進(jìn)行單殘基突變，用 Gly取代Ovispirin-1序列中第10 位的Ile，得到一個(gè)新的抗菌肽 Novispirin G-10，結(jié)果克服了對(duì)紅細(xì)胞的溶血性，替換前35 μmol/L的Ovispirin-1對(duì)人和綿羊紅細(xì)胞高達(dá)70%，而同樣肽濃度的Novispirin G-10的溶血性為2.5%，降低了96.4%，并提高了抗菌活性。

截取天然抗菌肽的部分序列：將含29個(gè)氨基酸的SMAP-29截短，嘗試篩選到抗菌活性更高，溶血性較低的短肽方面的做了大量的研究。得到的截短的SMAP-29抗菌肽22個(gè) (表1)，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究，這些截短肽中最有代表的是從SMAP-29的N 端截取的含有 18個(gè)氨基酸的 Ovispirin，但是Ovispirin的高溶血性決定其不能成為優(yōu)秀的藥物開發(fā)肽前體，所以產(chǎn)生了Ovispirin-1。

在基于 SMAP-29一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中往往將截取天然抗菌肽的部分序列法、殘基替換和序列模板法等結(jié)合使用設(shè)計(jì)篩選新的抗菌肽，SMAP-29一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)路線總結(jié)見圖3。

圖3 SMAP-29一級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)路線[13,27,41-42]Fig. 3 General design route for SMAP-29[13,27,41-42].

4.2.2 基于SMAP-29二級(jí)結(jié)構(gòu)功能及分子設(shè)計(jì)

SMAP-29二級(jí)結(jié)構(gòu)是兩親線性α-螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中任何改變都可能導(dǎo)致活性減弱或消失，但也可通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)分子設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)降低毒性的目的，二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)考慮以下物理化學(xué)因素：大小、氨基酸序列、電荷、螺旋程度、疏水性、兩親性、親疏水面的夾角。

大小：即肽鏈長(zhǎng)度，肽鏈長(zhǎng)度的改變影響了抗菌肽的疏水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及在水溶液和細(xì)胞膜上的狀態(tài)，從而改變了抗菌肽對(duì)膜的結(jié)合能力。最早研究者認(rèn)為要形成橫跨膜的通道，最少應(yīng)含 20個(gè)氨基酸殘基，其后發(fā)現(xiàn)有些抗菌肽僅由 12個(gè)氨基酸殘基組成?！皻痔骸蹦Ｐ驼J(rèn)為抗菌肽通過(guò)和膜結(jié)合后改變其穩(wěn)定性從而引起細(xì)胞死亡，不必形成跨膜通道，這可以很好地解釋短肽的抗菌機(jī)制。短肽有廣譜抗菌性傾向，為了平衡電荷，長(zhǎng)度可以適當(dāng)加長(zhǎng)，在10~30個(gè)氨基酸內(nèi)效果也較為理想。經(jīng)過(guò)分子設(shè)計(jì)后的 SMAP-29肽家族一般含十多個(gè)氨基酸。

氨基酸序列：天然抗菌肽具有不同的氨基酸序列，大約有50%的疏水性殘基，由Pro或Gly殘基形成“鉸鏈”或“扭”。設(shè)計(jì)上序列安排主要參考天然兩親α-螺旋抗菌肽來(lái)進(jìn)行，并考慮N端和C端殘基的選擇和修飾。Tossi研究團(tuán)隊(duì)[44]分析了許多天然兩親α-螺旋抗菌肽并得出一些共同的規(guī)律，前18個(gè)氨基酸序列模板見表3，Gly出現(xiàn)在序列第1位的肽序列大約占70%以上；Lys出現(xiàn)在第8位的肽序列大約占50%以上；SMAP-29通過(guò)肽模板序列分析了1~18位的氨基酸，得出其氨基酸模序位：第1位是Arg，2、13位Gly代替了疏水性殘基，11位疏水性Ala代替了親水性氨基酸。

電荷：陽(yáng)離子抗菌肽的電荷影響其活性與選擇性毒性，Weistroffer等[26]認(rèn)為電荷對(duì)抗菌活性方面的影響比肽鏈長(zhǎng)度和氨基酸序列更重要，增加陽(yáng)離子電荷，能增強(qiáng)對(duì)G?菌的抗菌活性 (少數(shù)報(bào)道可增強(qiáng)抗G+菌的活性)。一般認(rèn)為當(dāng)陽(yáng)離子抗菌肽的電荷小于+5時(shí)，抗菌活性隨正電荷數(shù)增加而增加；當(dāng)電荷大于+7時(shí)，增加正電荷對(duì)活性影響不大?？紤]具有一定抗菌潛力和廣度的要求，電荷控制在+3~+9內(nèi)較為合適。

螺旋程度：穩(wěn)定的α-螺旋形式有助于SMAP-29保持較好的抗菌活性。研究表明減少 α-螺旋抗菌肽關(guān)鍵位置上 (7、8、12和14) 的Pro，有降低α-螺旋的傾向，而且降低了抗菌活性。許多研究證明 α-螺旋程度對(duì)肽的細(xì)胞毒性 (中性膜) 比對(duì)抗菌活性(帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜) 的影響更大[45]。Zelezetsky等[44]通過(guò)測(cè)定在三氟乙醇水溶液中α-螺旋度，證明溶血性也與 α-螺旋的構(gòu)象相關(guān)。盡管許多研究推測(cè)α-螺旋度與抗菌活性、溶血性、細(xì)胞毒性有關(guān)，但是目前尚未建立幾者之間的相關(guān)參數(shù)。

疏水性：抗菌肽的總體疏水性是肽鏈序列中所有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)共同作用的結(jié)果。疏水作用對(duì)其活性的影響可通過(guò)改變肽鏈中 Leu、Ile、Val數(shù)量進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)：增加分子的疏水性，抗菌肽的抗菌活性和細(xì)胞毒性 (包括溶血性) 同時(shí)增加[46]。這是由于疏水基團(tuán)在抗菌肽插入細(xì)胞膜的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。另外，由于疏水基團(tuán)的存在，肽鏈在溶液中可以通過(guò)疏水作用形成多聚體，增加了對(duì)真核細(xì)胞膜的親和力；同時(shí)也增加了抗菌肽形成兩親α-螺旋的能力，而α-螺旋的增加也提高了抗菌肽的穩(wěn)定性。Boman[47]提出多肽側(cè)鏈氨基酸的自由能量可以從環(huán)己烷轉(zhuǎn)移到水中能預(yù)測(cè)多肽的副作用(細(xì)胞毒性)，并建立了相關(guān)指數(shù) (Boman指數(shù))，但是檢測(cè) SMAP-29和同系物后發(fā)現(xiàn)并不能建立較好的參數(shù)，相關(guān)度較差。

兩親性：兩親性決定其能否有效插入細(xì)菌細(xì)胞膜內(nèi)，形成疏水通道，SMAP-29二級(jí)結(jié)構(gòu)為兩親α-螺旋，即沿螺旋軸平行的兩個(gè)側(cè)面，殘基排列呈“螺旋輪”(Helix wheel) 分布，一側(cè)親水殘基集中，顯親水性；另外一側(cè)疏水殘基，顯疏水性。這樣，兩親性在螺旋的兩個(gè)異極性側(cè)面上形成了疏水力矩(Hydorphobic moment)，并與α-螺旋在N端和C端形成的電荷偶極一起，對(duì)抗菌肽活性起關(guān)鍵作用，多肽疏水力距可通過(guò)Eisenberg方程式獲得。通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽的兩親性為 50%~60%時(shí)抗菌活性最好，但是Travis等[25]研究認(rèn)為抗菌活性與疏水力矩成正比例。

親疏水面的夾角：Tossi等[48]認(rèn)為一般α-螺旋結(jié)構(gòu)中親疏水面角度為140°~180°時(shí)抗菌活性最好。夾角是140°時(shí)疏水部分對(duì)應(yīng)SMAP-29序列中的8~17位氨基酸，包含大量疏水氨基酸。溶血性也與親疏水面角度相關(guān)，理論上減小SMAP-29 α-螺旋上的親疏水面夾角可以促進(jìn)SMAP-29的治療指數(shù)，實(shí)際中測(cè)定發(fā)現(xiàn) EC50與 MIC值不同，EC50的降低往往是通過(guò)增加夾角角度實(shí)現(xiàn)。

表3 天然來(lái)源的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽1~18個(gè)氨基酸的序列模板Table 3 Sequence template for amino acids 1?18 of natural amphipathic α-Helical antimicrobial peptides

5 SMAP-29基因重組表達(dá)及轉(zhuǎn)基因

SMAP-29分子量小，直接從綿羊骨髓組織中提取純化天然抗菌肽存在一定的困難，而且產(chǎn)量有限，所以化學(xué)合成和基因工程表達(dá)法是獲得抗菌肽SMAP-29的主要手段。但化學(xué)合成抗菌肽成本高，而通過(guò)基因工程表達(dá)抗菌肽基因則由于抗菌肽分子小、易被蛋白酶降解、表達(dá)產(chǎn)物可能對(duì)宿主有害，從而影響了基因的高水平表達(dá)。Morassuttia等以內(nèi)含子介導(dǎo)的方式在大腸桿菌中融合表達(dá)了SMAP-29，產(chǎn)物用親和層析、高壓液相色譜純化，抗菌活性較化學(xué)合成的SMAP-29弱[49]。韓福郎選用大腸桿菌偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成了SMAP-29基因，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了抗菌肽SMAP-29[50]。

牛明福等[40]為了得到高活性的抗菌肽，將4種抗菌肽 PG-1、蟹防御素 (SD)、碧蝽抗菌肽Metalnikowin-2A) 和 SMAP-29串聯(lián)在畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中成功分泌表達(dá)，抑菌試驗(yàn)表明串聯(lián)的抗菌肽抑菌效果優(yōu)于SD。任耀軍等[51]也將SMAP-29在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。Morassutti等將SMAP-29基因轉(zhuǎn)到在煙草植物中[52]。

6 展望

SMAP-29家族抗菌肽具有廣譜抗菌活性包括抗革蘭氏陽(yáng)/陰性菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、抗螺旋體、抗衣原體和中和抗內(nèi)毒素活性，并且有作用機(jī)制獨(dú)特、快速殺滅細(xì)菌的特點(diǎn)?？咕囊郧暗难芯繜狳c(diǎn)主要集中在從各種各樣的生物或同一種生物不同器官中提取、鑒定新的天然抗菌肽，經(jīng)過(guò)30多年的研究，天然中存在的抗菌肽已經(jīng)基本發(fā)掘，筆者認(rèn)為以后抗菌肽的研究熱點(diǎn)將主要在抗菌肽開發(fā)應(yīng)用方面，包括：從目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然抗菌肽庫(kù)中進(jìn)行結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和改造，盡量提高抗菌活性而降低細(xì)胞毒性；抗菌機(jī)制的深入研究；基因工程重組、高效表達(dá)及多肽藥物的臨床前試驗(yàn)研究。所以降低細(xì)胞毒性提高活性、穩(wěn)定性仍然是SMAP-29家族抗菌肽研究中需要解決的重大問題。

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