羥基紅花黃色素A的提純新工藝研究

(鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州 450001)

紅花(Carthamus tinctorius L.)屬于雙子葉植物綱的菊科一年生草本植物［1］。具有活血通經(jīng)、祛痛止痛的功效［2］，是中醫(yī)傳統(tǒng)的活血化瘀藥。紅花化學(xué)成分復(fù)雜，生物活性廣泛，目前是當(dāng)今世界研究和應(yīng)用的“熱點”植物之一。紅花黃色素為紅花抗血栓的有效部位［3］，HSYA是紅花的主要藥效成分［4］，具有抗血小板激活因子的作用［5］，已作為治療心腦血管疾病的新藥被列入國家藥品標(biāo)準(zhǔn)［1］。

大孔吸附樹脂分離技術(shù)是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)［6］。大孔吸附樹脂是一類新型有機高分子聚合劑，具有穩(wěn)定性高、選擇性好、不受無機物的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、易于連續(xù)操作、成本低等諸多優(yōu)點。目前，大孔吸附樹脂已廣泛應(yīng)用于環(huán)保、化工、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。張亮等［7］研究了大孔吸附樹脂對紅花提取液的純化，制得的HSYA純度為35.7%。

中草藥原料中許多有效成分受熱易發(fā)生氧化、水解、聚合結(jié)構(gòu)變形等化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，從而影響藥效。膜分離技術(shù)是一種新型、高效的分離技術(shù)，以壓力差或電位差為推動力，利用篩分原理達(dá)到對不同分子量組分的分離、濃縮和提純［8］。將膜分離技術(shù)用于紅花提取液的分離純化過程，其相對溫和的操作條件更利于保持產(chǎn)品的性能穩(wěn)定［9］并且節(jié)能。

目前報道的關(guān)于純化HSYA的方法很多，但是HSYA的純度不夠高，難以達(dá)到注射劑用藥的要求，本文在前期研究的基礎(chǔ)上，旨在探討新的工藝路線，為制備高純度、高附加值的HSYA產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料和裝置

紅花，購于河南農(nóng)科院，產(chǎn)地新鄉(xiāng);羥基紅花黃色素A對照品，HPLC 99%，四川省維克奇生物科技有限公司;甲醇，色譜純99.9%;磷酸，分析純85%;無水乙醇，分析純99.7%;乙醇，醫(yī)用酒精95%;PES10超濾膜，上海亞東核級樹脂有限公司;大孔吸附樹脂，滄州寶恩化工;FILMTEC納濾膜。

電子分析天平，BS224S，北京賽多麗儀器系統(tǒng)有限公司;紫外/可見分光光度計，UV－2450，日本島津公司;高效液相色譜儀，Agilent 1100，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

通過靜態(tài)吸附、脫附實驗選取適宜的大孔吸附樹脂;通過膜性能的測定選取適宜的納濾膜。在前期研究的基礎(chǔ)上，制備HSYA提取液，經(jīng)過微濾除去固體顆粒物質(zhì)，微濾透過液作為本研究的原料液。精制原料液的工藝流程如圖1所示。

圖1 HSYA精制工藝流程圖

通過超濾過程除去大分子物質(zhì)，通過大孔吸附樹脂吸附、洗脫劑洗脫，收集醇洗脫液，最后經(jīng)納濾濃縮得濃縮液(浸膏狀)。水溶解浸膏物，采用HPLC檢測溶液中HSYA的純度。

1.3 分析方法

1.3.1 HSYA 的提取率

HSYA提取率的計算公式為:

式中:c為n次提取液混合后溶液中HSYA的濃度，g/L;V為n次提取液混合后溶液的總體積，mL;m0為所用紅花的質(zhì)量，mg。

1.3.2 HSYA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

利用紫外可見分光光度計，在波長401 nm處，測定不同濃度HSYA的吸光度，繪制HSYA對照品的吸光度—濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取HSYA對照品13.8 mg，蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，得到濃度為 0.276 g/L 的 HSYA 溶液。精確移取0.7、0.8、1.0、1.1、1.3、1.5、1.7、1.9 mL 于 25 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。以各溶液在401 nm處的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，溶液的濃度c為橫坐標(biāo)做圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為 A=0.03851c+0.00688(r=0.99994)，線性范圍:7.728 ～20.976 mg/L。其中，c的單位為 g/L。

1.3.3 HPLC 色譜條件

色譜柱:ZORBAX SB－C18 5 μm 4.6 × 250 mm;流動相甲醇:0.5%磷酸水溶液(體積比40∶60);流速:0.8 mL/min;柱溫:20℃;檢測波長:401 nm。以保留時間定性，峰面積定量，外標(biāo)法計算。

1.3.4 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率的測定

吸附量Q的計算公式如下:

式中:Q為吸附量，mg HSYA/g樹脂;c0為吸附前溶液的濃度，g/L;ct為吸附后溶液的濃度，g/L;V為溶液體積，mL;W為樹脂質(zhì)量，g。

解吸率的計算公式如下:

式中:c為濾液中HSYA的濃度，g/L;V為濾液體積，mL;Q為樹脂的吸附量，mg HSYA/g樹脂;W1為吸附飽和的樹脂質(zhì)量，g。

1.3.5 膜分離性能的測定

截留率R的計算公式如下:

式中:c1和c2分別為原料液和透過液中HSYA的濃度，g/L。

滲透通量的計算公式如下:

式中:V為透過液體積，L;S為膜的有效面積，m2;t為取樣時間，h;J為滲透通量，L/(m2·h)。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 HSYA 的提取

通過正交實驗確定了最優(yōu)的提取HSYA的工藝條件為:水提取，提取溫度45℃，提取時間45 min，料液比為1∶20，提取2次。在最佳條件下提取HSYA的平均提取率為7.516 5%。提取時各因素對提取率的影響大小依次是:提取時間＞提取次數(shù)＞提取溫度＞料液比。

2.2 大孔吸附樹脂的選取

除了大孔吸附樹脂的分子結(jié)構(gòu)外，宏觀結(jié)構(gòu)對其吸附量、吸附速度以及吸附選擇性等性能也有一定的影響。樹脂的宏觀結(jié)構(gòu)主要包括顆粒的形狀、粒徑、粒徑分布、孔隙率、孔的形狀、孔的大小、孔徑分布以及比表面積等。9種大孔吸附樹脂的物理參數(shù)如表1所示。

表1 選用樹脂的物理參數(shù)

吸附量是衡量大孔吸附樹脂分離天然產(chǎn)物的重要技術(shù)參數(shù)之一，不同樹脂對不同成分的吸附量不同，這是基于樹脂對物質(zhì)具有選擇吸附的能力。本實驗選擇了9種大孔樹脂對HSYA的吸附量和解吸率進(jìn)行了探討，結(jié)果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，對HSYA吸附量較好的樹脂有HPD200A、HPD300、HPD100、HPD700 和 HPD722。大孔吸附樹脂的比表面積影響樹脂的吸附量，比表面積越大，吸附量也越大，同時樹脂的孔徑也影響吸附量，孔徑太大或者太小吸附量都會降低，HPD200A的比表面積和孔徑比較適中，吸附量最大;HPD100A的比表面積小，孔徑大，導(dǎo)致吸附量最小。

圖2 9種樹脂對HYSA的吸附量

圖3 9種樹脂的解吸率

由圖3可知，樹脂 HPD100的解吸率最高，HPD700的解吸率最低，但樹脂的解吸率都普通較高。樹脂的吸附強度和洗脫劑的強度影響樹脂的解吸率，在同一洗脫劑下，主要是樹脂的吸附強度影響解吸率，只要樹脂對目標(biāo)成分的吸附?jīng)]有達(dá)到死吸附，解吸率都不會太低。

2.3 納濾膜的選取

植物有效成分提取分離常用的蒸發(fā)分離主要基于不同組分揮發(fā)性的差異，很可能對熱敏性物質(zhì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，并且耗能。而膜分離主要基于分子的大小(分子半徑與其相對分子質(zhì)量相關(guān))，納濾膜的截留相對分子質(zhì)量介于超濾膜和反滲透膜之間，對相對分子質(zhì)量在200～1 000之間的低分子有機物以及多價鹽有較好的截留效果。除了考慮對HSYA的截留外，同時還應(yīng)考慮膜的滲透通量，這是選擇用膜的兩個關(guān)鍵參數(shù)。實驗用膜的性能參數(shù)見表2。

表2 膜性能參數(shù)表

3種納濾膜的分離性能結(jié)果如表3所示。采用切割相對分子質(zhì)量為1 000的NF270－400膜作為分離膜，其滲透通量最大，但對HSYA的截留率相對而言偏低;切割相對分子質(zhì)量為300的NF90－400膜的截留率最高，但滲透通量最小;切割相對分子質(zhì)量為600的NF200－400膜的截留率與NF90－400膜的截留率相當(dāng)，但其滲透通量要大于NF90－400膜的滲透通量。由此可知，納濾膜的切割相對分子質(zhì)量越小，其對HSYA的截留率越高，同時其滲透通量也越小。

表3 3種類型的膜對分離性能的影響

2.4 納濾膜的截留率R的變化

實驗過程中3條工藝路線中NF200－400納濾的截留率如表4所示。

表4 3條工藝路線中納濾膜NF200－400的截留率

由表4可知，濃度影響膜的截留率，濃度越小，截留率也越大;乙醇的存在影響膜的截留率，可以使膜的截留率增大，由于HSYA易溶于水，不容易無水乙醇，乙醇的存在可以使部分HSYA沉淀，乙醇的濃度越大，截留率也隨之增大。

2.5 HSYA提純工藝路線的評價

超濾過程是利用一種壓力活性膜，在外界推動力(壓力)作用下截留料液中的膠體、顆粒和相對分子質(zhì)量相對較高的物質(zhì)，而相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)透過膜的分離過程。通過超濾過程，可除去大部分的膠體，大分子的物質(zhì)以及大量的有機物。由于HSYA易溶于水，不溶于無水乙醇，溶解度隨著乙醇濃度的增加而減小，乙醇的存在使HSYA部分沉淀。因此，先經(jīng)超濾過程除去大分子物質(zhì)，再經(jīng)過大孔吸附樹脂的吸附、洗脫過程富集HSYA，最后經(jīng)過納濾濃縮得到較高純度的HSYA產(chǎn)品。通過高效液相色譜法檢測產(chǎn)品中HSYA的純度，溶液Ⅰ中HSYA占58.250%，溶液Ⅱ中 HSYA 占50.700%，溶液Ⅲ中HSYA占54.072%。通過超濾過程除去溶液中的大分子物質(zhì)，由工藝路線一制得的產(chǎn)品純度較高，即58.250%。

3 結(jié)論

通過不同工藝流程的試驗，發(fā)現(xiàn)采用PES10超濾膜、大孔吸附樹脂HPD200A與NF200－400納濾膜相結(jié)合的方法純化HSYA，產(chǎn)品純度最高可達(dá)到58.25%。

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