農(nóng)田雜草抗藥性檢測(cè)方法研究進(jìn)展

董立堯, 呂 波, 徐江艷, 李 俊

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部作物病蟲害監(jiān)測(cè)與防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院/江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095)

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農(nóng)田雜草抗藥性檢測(cè)方法研究進(jìn)展

董立堯1，2, 呂 波2, 徐江艷1, 李 俊1，2

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部作物病蟲害監(jiān)測(cè)與防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院/江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095)

雜草抗藥性問題備受全球關(guān)注。文章通過檢索國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的有關(guān)雜草抗藥性的文獻(xiàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室常用的雜草抗藥性檢測(cè)方法進(jìn)行了概述，并將雜草抗藥性檢測(cè)方法歸納為整株水平、器官或組織水平、細(xì)胞或細(xì)胞器水平以及分子水平，并對(duì)這些方法進(jìn)行了簡(jiǎn)要分析，可為研究人員或農(nóng)技推廣人員根據(jù)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等不同需要提供相應(yīng)的雜草抗藥性檢測(cè)方法。

雜草； 抗藥性； 檢測(cè)

1942年2,4-滴的發(fā)現(xiàn)揭開了近代化學(xué)除草的新紀(jì)元。由于除草劑連續(xù)使用，很快導(dǎo)致了雜草抗藥性的產(chǎn)生[1]。1950年在美國(guó)夏威夷的甘蔗田發(fā)現(xiàn)了多年生雜草竹節(jié)花(又稱鋪散鴨跖草，Commelinadiffusa)對(duì)2,4-滴產(chǎn)生了抗藥性。從20世紀(jì)80年代開始，世界范圍內(nèi)大量應(yīng)用除草劑，全球抗藥性雜草的發(fā)展幾乎呈直線上升。根據(jù)Heap統(tǒng)計(jì)，截至2010年10月，全球已有194種(114種雙子葉，80種單子葉)雜草的348個(gè)生物型在各類農(nóng)田系統(tǒng)對(duì)19類化學(xué)除草劑產(chǎn)生了抗藥性[2]?？顾幮噪s草已成為雜草治理和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴(yán)重威脅，由其引發(fā)的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)安全問題倍受全球關(guān)注。

隨著雜草抗藥性研究的不斷深入，雜草抗藥性檢測(cè)方法也不斷創(chuàng)新。1970年美國(guó)學(xué)者Ryan首次公開報(bào)道了歐洲千里光(SeneciovulgarisL.)對(duì)三氮苯類除草劑西瑪津和莠去津產(chǎn)生了抗性，提出了整株植物測(cè)定方法，標(biāo)志著雜草抗藥性生物測(cè)定方法的誕生。隨著科學(xué)研究的深入和科學(xué)技術(shù)的創(chuàng)新，雜草抗藥性檢測(cè)方法不斷發(fā)展，出現(xiàn)了種子培養(yǎng)皿測(cè)定法、葉片葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定法、DNA分析法等不同水平的檢測(cè)方法。為了便于研究人員或農(nóng)技推廣人員在具體操作過程中根據(jù)快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)等不同的需要選擇適宜的檢測(cè)方法，本文通過檢索文獻(xiàn)，歸納分析了目前比較常用的雜草抗藥性檢測(cè)方法。

1 常用雜草抗藥性檢測(cè)方法

1.1 整株水平測(cè)定方法

1.1.1 整株植物測(cè)定法 一般所使用的方法為Ryan法(1970)?；静僮鳎菏紫葟拈L(zhǎng)期單一使用某除草劑并懷疑有抗藥性的田塊及未使用過該除草劑的田塊采集雜草種子，按小區(qū)大田播種或溫室盆栽，在播后芽前或苗后進(jìn)行常規(guī)施藥處理。藥劑設(shè)置不同劑量或濃度梯度，計(jì)算不同劑量下雜草的出苗率、死亡率、鮮重抑制率等指標(biāo)，與對(duì)照比較，以確定抗藥性水平[3]。2007年楊彩宏等利用整株植物測(cè)定法研究了江蘇、安徽11個(gè)點(diǎn)油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈的抗藥性，并用同樣的方法進(jìn)行了相關(guān)藥劑交互抗性的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)句容點(diǎn)的日本看麥娘對(duì)此藥劑已產(chǎn)生明顯抗性，并對(duì)芳氧基苯氧基丙酸酯類其他藥劑產(chǎn)生了不同程度的交互抗性[4]。

1.1.2 幼苗檢測(cè)法 該法基本操作：將懷疑對(duì)某種除草劑有抗藥性及敏感的雜草種子分別放在盛有水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待根長(zhǎng)至3～5 mm時(shí)，把帶根種子轉(zhuǎn)移到封閉瓶中的濾紙上，將不同濃度藥劑溶液加到瓶中，在一定條件下培養(yǎng)，通過測(cè)量芽長(zhǎng)或胚芽鞘長(zhǎng)度測(cè)定雜草抗藥性水平[5]。2002年Retrum等采用幼苗檢測(cè)法研究了大狗尾草對(duì)烯禾啶的抗藥性，發(fā)現(xiàn)該法可以有效地區(qū)分抗性和敏感種群[6]。

1.2 器官或組織水平測(cè)定方法

1.2.1 培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法 這種方法是把催芽的雜草種子放在加入藥劑的瓊脂平面或浸藥的濾紙上培養(yǎng)，通過測(cè)定發(fā)芽數(shù)、主根長(zhǎng)、鮮重等指標(biāo)診斷抗藥性水平。2007年楊彩宏等在油菜田日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈抗藥性研究中也使用了培養(yǎng)皿種子檢測(cè)方法，結(jié)果與整株植物測(cè)定法趨勢(shì)一致，結(jié)果相符[4]。2008年丁君等采用培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法測(cè)定了再生煙草種子對(duì)苯磺隆的抗性，以及對(duì)煙嘧磺隆、噻吩磺隆、嘧硫草醚和莠去津的交互抗性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)苯磺隆抗性選育的再生煙草抗性顯著提高，并且對(duì)這4種除草劑存在不同程度的交互抗性[7]。

1.2.2 分蘗檢測(cè)法 該方法通常先將雜草種子種植在粗沙和泥炭(體積比為1 ∶3)的混合物中，在溫室內(nèi)培養(yǎng)至3葉期(第3葉未充分展開)時(shí)，選取正生長(zhǎng)的分蘗，去根，然后放在一定的高濃度藥劑溶液中，一段時(shí)間后，通過比較第3葉壞死程度來評(píng)價(jià)雜草的抗藥性水平[8]。2000年Kim等在研究稗草對(duì)敵稗和精口惡唑禾草靈的抗藥性時(shí)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)分蘗的壞死程度可以快速檢測(cè)抗性和敏感雜草生物型[9]。

1.2.3 花粉粒萌發(fā)法 按分蘗檢測(cè)法種植雜草，剪取剛從穎片抽出的具花藥的穗，把花粉震落到0.25%含一系列濃度除草劑的固體瓊脂培養(yǎng)基上。在一定條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，用顯微鏡(200倍)觀察花粉萌發(fā)情況。萌發(fā)花粉計(jì)數(shù)以花粉管長(zhǎng)度至少達(dá)半個(gè)花粉粒長(zhǎng)度為準(zhǔn)。在時(shí)間和劑量的最適選擇下，根據(jù)萌發(fā)花粉數(shù)的多少來判定抗性和敏感性生物型[10-12]。2007年Burke等用花粉粒萌發(fā)法研究了假高粱對(duì)ACC酶抑制劑類除草劑的抗藥性，發(fā)現(xiàn)用烯草酮處理6 d后，抗性和敏感生物型在500 nm處的吸光度存在差異[13]。

1.2.4 葉圓片浸漬技術(shù)測(cè)定法 首先將葉圓片浸漬在含有一定濃度除草劑的磷酸緩沖溶液的試管中，抽真空，待葉圓塊下沉至試管底部后，解除真空，加入少量碳酸氫鈉溶液，照光。對(duì)除草劑不敏感或產(chǎn)生抗藥性的生物型，光合作用未被抑制，組織間產(chǎn)生足夠多的O2，葉圓片上浮；而對(duì)除草劑敏感的生物型，光合作用受抑制，不能產(chǎn)生足夠多的O2，圓片仍沉在試管底部。根據(jù)一定時(shí)間內(nèi)上浮的葉圓片數(shù)或上浮需要的時(shí)間來比較光合作用的強(qiáng)弱程度，以此來確定對(duì)除草劑敏感或抗性生物型[12,14]。

1.3 細(xì)胞或細(xì)胞器水平測(cè)定方法

1.3.1 葉片葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定法 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定法機(jī)理是：在黑暗的條件下用閃光燈照射光合作用抑制劑類除草劑處理過的葉片時(shí)，光合作用抑制劑阻斷電子由QA到QB的傳遞，光系統(tǒng)Ⅱ的還原端被中斷，捕獲的光能不能往下傳遞，葉綠素a處于激發(fā)態(tài)，以熒光的方式釋放能量，通過測(cè)定葉綠素a發(fā)射熒光的強(qiáng)弱檢測(cè)抗藥性，抗性植株葉片表面的熒光強(qiáng)度小，敏感性生物型葉片表面的熒光強(qiáng)度大，所以，根據(jù)葉片表面的熒光強(qiáng)度，可區(qū)分抗藥性生物型和敏感生物型[8]。1992年Lehoczki等用相同濃度的百草枯處理抗性和敏感性小蓬草生物型后，二者均快速表現(xiàn)出典型的百草枯藥害癥狀，CO2固定和葉綠素?zé)晒馐艿揭种?、氧釋放減少、已烷生成受到刺激，不同的是百草枯對(duì)敏感生物型的抑制不可逆轉(zhuǎn)，而抗藥性生物型植株在光照中得到恢復(fù)，而且光照強(qiáng)度的增加對(duì)葉綠素?zé)晒獾幕謴?fù)作用非常明顯[15]。

1.3.2 離體葉綠體測(cè)定方法 離體葉綠體測(cè)定法的研究證實(shí)了雜草抗藥性是由于改變了類囊體膜上的光系統(tǒng)Ⅱ成分，從而改變了光系統(tǒng)Ⅱ還原端的電子傳遞反應(yīng)。葉綠體的提取采用的是酶解法，離體葉綠體光還原反應(yīng)的測(cè)定包括希爾反應(yīng)和熒光反應(yīng)。希爾反應(yīng)是將葉綠體提取，放入希爾反應(yīng)介質(zhì)中，有氧化劑存在(DCPIC)時(shí)，在光照下會(huì)放出氧氣，同時(shí)將氧化劑還原。熒光反應(yīng)是通過測(cè)定葉片中熒光強(qiáng)度來鑒定光系統(tǒng)Ⅱ的功能。葉綠體熒光測(cè)定須在黑暗中進(jìn)行，藍(lán)色閃光照射葉綠體懸浮液，葉綠素發(fā)射熒光，用光電極管測(cè)定發(fā)射的熒光，并記錄在X-Y記錄儀上[3,8]。此外，還可以通過測(cè)定葉綠素含量的變化檢測(cè)抗藥性。1990年Joseph等的研究表明，野燕麥對(duì)苯氧羧酸類除草劑禾草靈的抗藥性生物型和敏感性生物型葉片內(nèi)葉綠素a和葉綠素b的含量表現(xiàn)不同[16]。

1.3.3 光合速率測(cè)定法 由于抗光合作用抑制劑生物型雜草在光合作用抑制劑處理后其光合速率變化不大，而敏感生物型則受到嚴(yán)重抑制，因此，通過測(cè)定光合速率的變化研究光合作用抑制劑對(duì)植物或葉片的影響，可以檢測(cè)鑒定雜草抗藥性。主要方法有紅外線CO2測(cè)定法、氧電極測(cè)定法、pH比色法、氣流測(cè)定法、改進(jìn)的干重測(cè)定法和半葉法等[8]。1992年P(guān)reston等用百草枯處理敏感型大麥草，其體內(nèi)光合作用氧氣釋放被抑制了66%，而處理抗性大麥草生物型后，除草劑對(duì)光合作用氧氣釋放的抑制作用不明顯[17]。

1.3.4 呼吸速率測(cè)定法 測(cè)定方法可參照光合速率測(cè)定法[8]。

1.3.5 吸收和輸導(dǎo)測(cè)定法 任何一種除草劑要發(fā)揮其除草活性，必須條件是這種除草劑能被雜草吸收并將足以發(fā)揮作用的劑量運(yùn)輸?shù)阶饔貌课弧Ｒ虼?，除草劑在敏感雜草和抗性雜草體內(nèi)的吸收和輸導(dǎo)差異可用于檢測(cè)雜草抗藥性。Baerson等[18]和Lorraine-Colwill等[19]通過比較抗草甘膦的瑞士黑麥草和敏感的瑞士黑麥草生物型對(duì)草甘膦的吸收和輸導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)草甘膦在二者體內(nèi)的輸導(dǎo)差異明顯，敏感型體內(nèi)的草甘膦匯聚在植物的根，而抗性生物型體內(nèi)的草甘膦則匯聚在葉尖，他們認(rèn)為草甘膦在植物體內(nèi)隨蒸騰流快速向上移動(dòng)后被泵入木質(zhì)部，不能泵到韌皮部匯聚到生長(zhǎng)點(diǎn),即輸導(dǎo)方向的改變是產(chǎn)生抗藥性的原因。

1.3.6 酶活與代謝檢測(cè)法 對(duì)于一些靶標(biāo)已明確的除草劑，可通過測(cè)定靶標(biāo)酶或與靶標(biāo)酶催化的反應(yīng)存在密切關(guān)聯(lián)的酶的活性差異或某些代謝物質(zhì)量的差異判斷雜草抗藥性。例如，乙酰乳酸合成酶(ALS)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑在生產(chǎn)上應(yīng)用廣泛，作用位點(diǎn)均是細(xì)胞內(nèi)的重要生化反應(yīng)關(guān)鍵酶，通過作用于這些酶從而抑制細(xì)胞分裂，使組織失綠、黃化，植株逐漸死亡。因此，通過比較感抗生物型的ALS和ACCase相對(duì)活性的高低，便可以鑒定出抗藥性生物型[20-21]。2004年de Prado等發(fā)現(xiàn)抗性綠色狗尾草體內(nèi)的ACCaseⅠ對(duì)禾草靈的敏感程度比在敏感狗尾草中降低了30.8倍[22]。

此外，在若干雜草中，促進(jìn)除草劑代謝解毒也是導(dǎo)致產(chǎn)生抗性的原因，此種代謝作用主要是促進(jìn)細(xì)胞色素P450單加氧酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性而產(chǎn)生[23]。2010年韓瑞娟等在日本看麥娘對(duì)高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究中，發(fā)現(xiàn)了抗性生物型體內(nèi)細(xì)胞色素P450還原酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)的活性高于敏感日本看麥娘[24]。

1.4 分子水平檢測(cè)方法

分子生物學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫方法、DNA分析法、RNA分析法等，在雜草抗藥性研究中已得到廣泛和成功的應(yīng)用。

1.4.1 酶聯(lián)免疫法 酶聯(lián)免疫法[25](enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)始于20世紀(jì)70年代，是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預(yù)先結(jié)合到某種固相載體表面。測(cè)定時(shí)，將受檢樣品和酶標(biāo)抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原或抗體復(fù)合物。反應(yīng)終止時(shí)，固相載體上酶標(biāo)抗原或抗體被結(jié)合，其量與標(biāo)本中待檢抗體或抗原的量成一定比例。經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì)，加入酶反應(yīng)底物后，底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過定性或定量分析有色產(chǎn)物量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。2002年Reade等建立了田間酶聯(lián)免疫測(cè)定看麥娘谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)豐度檢測(cè)看麥娘對(duì)綠麥隆、異丙隆和精口惡唑禾草靈抗藥性的技術(shù)[26]。

1.4.2 DNA(或RNA) 分析法 對(duì)于已經(jīng)獲知編碼基因的除草劑靶標(biāo)酶，可使用DNA(或RNA)分析方法判斷雜草的抗藥性。該法通常先提取基因組總DNA(或RNA)，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過序列同源性分析便可檢測(cè)雜草的抗藥性。2008年Corbett等利用PCR-RFLP方法成功鑒定了抗性莧屬雜草體內(nèi)乙酰羥基酸合成酶(AHAS)的4處突變位點(diǎn)[27]。2009年盧宗志等采用PCR技術(shù)，分別對(duì)抗藥性和敏感性雨久花生物型的ALS基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和基因克隆，并對(duì)獲得的DNA序列片斷進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，與敏感性雨久花生物型ALS相比，抗藥性雨久花生物型的ALS基因共有3處發(fā)生突變[28]。

2 雜草抗藥性檢測(cè)方法的分析與討論

雜草抗藥性檢測(cè)方法多種多樣，除了上面介紹的方法外，還有傳統(tǒng)的田間觀察法、小球藻法、愈傷組織和懸浮培養(yǎng)法、原生質(zhì)體培養(yǎng)法等，但由于這些方法在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多不足，已很少使用。

從雜草抗藥性檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的要求考慮，可以選擇分子水平測(cè)定方法。酶聯(lián)免疫方法通過制備雜草產(chǎn)生抗藥性過程中某些關(guān)鍵酶變化的單克隆抗體，可以靈敏、專一、微樣、簡(jiǎn)單快速檢測(cè)雜草的抗藥性，該技術(shù)比其他檢測(cè)方法表現(xiàn)出更多的優(yōu)越性，靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少，而且操作簡(jiǎn)便快捷。但它也存在一些缺陷，如不能同時(shí)分析多種成分，對(duì)試劑選擇性高，對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)，對(duì)儀器要求嚴(yán)格，耗資大。DNA分析技術(shù)具有分析速度快、信息量大、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，但相對(duì)其他傳統(tǒng)技術(shù)所需成本要高。因此，對(duì)于一些靶標(biāo)已明確的除草劑，酶活與代謝檢測(cè)方法能準(zhǔn)確地檢測(cè)出抗藥性雜草生物型，同時(shí)還能進(jìn)一步研究雜草抗藥性機(jī)理的產(chǎn)生原因。

從雜草抗藥性檢測(cè)快速、經(jīng)濟(jì)的要求考慮，可以選擇培養(yǎng)皿種子生測(cè)法，該法是幼苗生測(cè)法的改進(jìn)，所需的植物培養(yǎng)時(shí)間較短，相對(duì)快速、廉價(jià)，尤其是對(duì)大量雜草種群的常規(guī)抗藥性檢測(cè)非常重要。但培養(yǎng)皿種子生測(cè)法要求供試的種子一定要有較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，否則會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的可靠性。對(duì)田間正在生長(zhǎng)的雜草，采用花粉粒萌發(fā)法可實(shí)現(xiàn)快速抗藥性檢測(cè)。

從雜草抗藥性檢測(cè)客觀、經(jīng)濟(jì)的要求考慮，可采用整株植物測(cè)定法，該法操作簡(jiǎn)便，所需試驗(yàn)條件易于滿足，田間和溫室試驗(yàn)方法均易掌握，可用大批植株同時(shí)進(jìn)行。但重復(fù)性較差，植物培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)。

從除草劑使用方式和作用機(jī)理的不同考慮，檢測(cè)土壤處理的除草劑，可以采用幼苗檢測(cè)法或培養(yǎng)皿種子檢測(cè)法。檢測(cè)莖葉處理的除草劑，可以采用整株植物測(cè)定法、分蘗檢測(cè)法。檢測(cè)內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑，可以采用吸收和輸導(dǎo)測(cè)定法。檢測(cè)光合作用抑制劑類除草劑，可以采用葉片葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定法、離體葉綠體測(cè)定法、葉圓片浸漬技術(shù)測(cè)定法或光合速率測(cè)定法。檢測(cè)呼吸作用抑制劑類除草劑，可以采用呼吸速率測(cè)定法。

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Research Advance on Detection Methods for Weed Herbicide-resistance

DONG Li-yao1，2, Lü Bo2, XU Jiang-yan1, LI Jun1，2

( 1. College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest Insects,Ministry of Agriculture,Nanjing 210095,China；2. College of Science,Nanjing Agricultural University/Jiangsu Key Laboratory of Pesticide Science,Nanjing 210095,China)

The weed herbicide-resistance problem has become a global concern recently. In order to provide a rapid,accurate and economic detection methods for agricultural research and extension workers,documents concerning detection methods of weed herbicide-resistance reported at home and abroad were outlined and analyzed according to its research level on whole plant, organ or tissue,cells or organelles and molecular base respectively.

weed; herbicide-resistance; detection

2011-03-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30971928)；江蘇省農(nóng)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2010年度項(xiàng)目。

董立堯(1960—)，男，博士，教授，從事除草劑毒理及抗藥性研究。Tel:(025)84395672; E-mail:dly@njau.edu.cn。

S451

A

1003-935X(2011)02-0001-04

董立堯,呂 波,徐江艷，等. 農(nóng)田雜草抗藥性檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 雜草科學(xué)，2011，29(2)：1-4,9.