γ-氨基丁酸A受體對丙泊酚、依托咪酯麻醉的介導(dǎo)作用

范 坤 ，張 敏 ，侯一平 ，2*

1.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎研究所，甘肅蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所，甘肅蘭州 730000

γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）是廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，GABA通過其受體（GABA receptors）發(fā)揮作用。GABA受體是一種五聚體膜蛋白，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分為三種類型GABAA、GABAB和GABAC受體[1]。 其中，GABAA受體，又分為 18 種亞型 α1～6、β1～4、δ、γ1～4、ρ1～3、ε。 GABAA受體屬于半胱氨酸環(huán)配體門控通道超家族，興奮后神經(jīng)細(xì)胞膜對氯離子通透性增加，膜外高濃度的氯離子順濃度差進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞膜電位產(chǎn)生超極化，神經(jīng)元的興奮性降低[2]。

丙泊酚、依托咪酯是臨床常用的兩種靜脈全身麻醉藥，它們直接或間接興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的敏感靶蛋白發(fā)揮麻醉作用，這種靶蛋白就是GABAA受體，但是它們對GABAA受體興奮位點(diǎn)不同，因而發(fā)揮著不同的麻醉作用。雖然丙泊酚、依托咪酯具體作用機(jī)制尚不清楚，但GABAA受體被認(rèn)為是重要靶點(diǎn)[3]。

1 GABAA受體對丙泊酚的介導(dǎo)作用

1.1 丙泊酚

丙泊酚由于其速效、短效、不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，成為目前臨床應(yīng)用最廣泛的靜脈麻醉藥。許多證據(jù)表明丙泊酚的麻醉作用與GABAA受體有關(guān)。使用膜片鉗技術(shù)觀察大鼠海馬錐形神經(jīng)元，丙泊酚可以增大GABA誘發(fā)的的內(nèi)向電流，并使GABA的濃度-反應(yīng)曲線左移，說明丙泊酚可以增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GABAA受體的抑制性調(diào)節(jié)反應(yīng)[4]。分離大鼠迷走神經(jīng)，發(fā)現(xiàn)丙泊酚呈劑量依賴性加強(qiáng)GABA的反應(yīng)，使GABA的濃度-反應(yīng)曲線左移，對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元丙泊酚能加強(qiáng)GABA引發(fā)的電流。說明丙泊酚可能增強(qiáng)了GABA與GABAA受體的作用。使用電流鉗技術(shù)，發(fā)現(xiàn)丙泊酚對小鼠丘腦皮層的抑制可以被GABAA受體拮抗劑或者氯離子通道阻斷劑所拮抗，丙泊酚還能增加GABAA受體抑制突出后電流傳遞的時(shí)間[5]。表明GABAA受體是丙泊酚的重要作用位點(diǎn)。

1.2 GABAA受體拮抗劑

大鼠靜脈注射非競爭性GABAA受體拮抗劑picrotoxin，可增加丙泊酚引起的對有害刺激不發(fā)生反應(yīng)50%有效劑量（ED50），競爭性GABAA受體拮抗劑gabazine也可起到相同的作用。小鼠腹腔注射GABAA受體激動(dòng)劑musimol，GABAA受體拮抗劑bicuculline觀察反正反射，發(fā)現(xiàn)musimol聯(lián)合丙泊酚要比單獨(dú)注射丙泊酚反正反射數(shù)目減少，bicuculline則起相反的作用。表明丙泊酚是通過GABAA受體間接產(chǎn)生麻醉作用。剝離大鼠大腦皮層，測量內(nèi)源性谷氨酸釋放，發(fā)現(xiàn)丙泊酚能通過GABAA受體抑制谷氨酸分泌，且這種作用可被bicuculline所抑制[6]。對大鼠腹腔注射丙泊酚，發(fā)現(xiàn)反正反射的消失呈劑量依賴性，丙泊酚聯(lián)合GABAA受體激動(dòng)劑gabazine比丙泊酚單獨(dú)給藥ED50明顯減小，與生理鹽水組相比，丙泊酚組睡眠關(guān)鍵部位-腹外側(cè)視前區(qū)c-fos表達(dá)明顯增加而覺醒的關(guān)鍵部位藍(lán)斑核、結(jié)節(jié)乳頭體核等c-fos表達(dá)明顯減少。提示丙泊酚不但可以增強(qiáng)GABA與GABAA受體的作用，還可以通過GABAA受體抑制促覺醒神經(jīng)元發(fā)揮麻醉作用。

1.3 丙泊酚對GABAA受體的作用途徑

不同濃度的丙泊酚對GABAA受體的作用途徑不同。Orser等[7]認(rèn)為低濃度（2～100 μm）的丙泊酚能增強(qiáng) GABA 誘發(fā)的全細(xì)胞電流，中間濃度（100～2 000 μm）的丙泊酚能直接激活 GABAA受體，而高濃度（＞2 000 μm）丙泊酚對 GABAA受體產(chǎn)生非競爭性抑制作用。對大鼠皮層細(xì)胞做細(xì)胞電生理記錄，發(fā)現(xiàn)在沒有GABA存在的情況下，丙泊酚可以直接激活細(xì)胞膜GABAA受體氯離子通道[8]。提示丙泊酚對GABAA受體的作用可以通過不同的途徑實(shí)現(xiàn)。

目前對丙泊酚在GABAA受體各亞基的作用位點(diǎn)尚不明確，大多數(shù)的研究表明，丙泊酚主要作用于GABAA受體β亞單位。β亞單位的TM2和TM3氨基酸序列的改變可影響丙泊酚的麻醉作用，α亞單位是GABAA受體復(fù)合物中不可缺少的部分，對丙泊酚麻醉作用無直接影響，但是可影響丙泊酚對GABA的調(diào)節(jié)效能。把GABAA受體β2亞單位置換為苯基丙氨酸，發(fā)現(xiàn)丙泊酚激活受體的量效曲線右移。使用基因打靶技術(shù)把大鼠GABAA受體β3亞單位氨基酸點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)丙泊酚對機(jī)體有害刺激反應(yīng)的抑制消失。近期Jonsson等[2]將GABAA受體β2、β3亞基氨基酸的289和290位點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)丙泊酚對GABAA受體的作用降低。提示β2、β3是丙泊酚作用的關(guān)鍵部位。

2 GABAA受體對依托咪酯的介導(dǎo)作用

2.1 依托咪酯

依托咪酯為咪唑類衍生物，對循環(huán)、呼吸系統(tǒng)影響較輕，是臨床上一種重要的靜脈麻醉藥。但是依托咪酯可以增加癲癇患者癲癇波的發(fā)生限制了其使用。依托咪酯主要通過調(diào)節(jié)GABAA受體氯離子通道產(chǎn)生麻醉作用，對其他配體門控通道無作用，它能夠增強(qiáng)GABAA受體的效能以及與配體結(jié)合的能力，間接抑制中樞興奮性遞質(zhì)的傳遞[9]。在大腦皮層，依托咪酯能夠明顯增加GABA和muscimol與GABAA受體結(jié)合能力和結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目。依托咪酯還能夠增強(qiáng)苯二氮卓類藥物與其受體的結(jié)合能力而增加藥物的效能，并且這種作用呈劑量依賴性，可以被bicuculline拮抗[9]。

2.2 依托咪酯與其在GABAA受體作用位點(diǎn)的關(guān)系

GABAA受體β3亞單位氨基酸殘基被認(rèn)為是依托咪酯重要作用位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明依托咪酯作用于GABAA受體β3亞單位TM2跨膜區(qū)Asp265氨基酸，而丙泊酚、巴比妥鹽等麻醉藥對此位點(diǎn)無作用[10-11]。然而應(yīng)用依托咪酯的衍生物卻得出不同的結(jié)論，活體實(shí)驗(yàn)表明依托咪酯與其衍生物R（+）azietomidate具有相同的麻醉效能，離體實(shí)驗(yàn)也表明兩者同樣都具有增強(qiáng)GABAA受體效能的能力，與依托咪酯相比，產(chǎn)生同樣效能時(shí)，R（+）azietomidate 與 s（-）azietomidate 劑量比約為 1∶10。azietomidate存在有 2個(gè)穩(wěn)定的殘基，α1Met-236和β3Met-286。提示依托咪酯的作用位點(diǎn)不僅僅是在β3亞單位氨基酸殘基。GABAA受體α亞單位和β亞單位azietomidate作用位點(diǎn)Met236氨基酸M286氨基酸突變蛙，作細(xì)胞電生理記錄發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，依托咪酯組GABAA受體離子通道開啟功能增強(qiáng)，說明依托咪酯對GABAA受體的調(diào)節(jié)作用降低。藥理學(xué)標(biāo)記證明依托咪酯對β和α亞單位之間的蛋氨酸位點(diǎn)的親和力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對β亞單位位點(diǎn)的親和力[12]。

應(yīng)用電壓鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，依托咪酯能夠增加GABAA受體氯離子內(nèi)流，引起細(xì)胞膜的超極化，降低神經(jīng)元興奮性信號的傳遞[13]。前期研究認(rèn)為依托咪酯和巴比妥類藥物不同，其在GABA不存在的情況下不能直接激活GABAA受體。但是對大鼠脊髓神經(jīng)元做電生理記錄顯示，低濃度（10 μm）依托咪酯能增強(qiáng)GABA與GABAA受體結(jié)合能力，中間濃度（10～1 000 μm）能直接激活 GABAA受體，高濃度（＞1 000 μm）能抑制GABA與GABAA受體結(jié)合能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)依托咪酯能延長GABA作用突觸后受體的時(shí)間。在大鼠海馬神經(jīng)元，不同劑量的依托咪酯對GABAA受體作用方式也不同[14]。

另有一些研究顯示，依托咪酯的作用位點(diǎn)還位于其他亞基。應(yīng)用基因敲除小鼠研究依托咪酯的藥理作用，結(jié)果顯示β2亞單位敲除小鼠依托咪酯的鎮(zhèn)靜作用消失，而麻醉作用與未敲除小鼠相同，說明β2亞單位和依托咪酯的鎮(zhèn)靜作用有關(guān)，而β3亞單位和麻醉作用有關(guān)[15]。

應(yīng)用GABAA受體β3亞單位敲除小鼠研究β3亞單位對心血管、呼吸、體溫、鎮(zhèn)靜作用的影響，血?dú)夥治霭l(fā)現(xiàn)，依托咪酯對β3亞單位敲除小鼠呼吸系統(tǒng)的影響消失，但是對血液系統(tǒng)、體溫和鎮(zhèn)靜作用仍然存在，說明GABAA受體與依托咪酯的呼吸抑制有關(guān)，而與循環(huán)抑制、低溫、鎮(zhèn)靜作用無關(guān)[16]。

海馬椎體神經(jīng)元GABAA受體α5亞單位敲除小鼠，依托咪酯的麻醉作用降低，而鎮(zhèn)靜作用仍然存在。在未敲除小鼠，依托咪酯能夠通過GABAA受體增加抑制性信號的傳導(dǎo)，降低興奮性信號的傳導(dǎo)。在α5亞單位敲除小鼠這種作用消失，而依托咪酯的鎮(zhèn)靜作用仍然存在[17]。

其他研究者發(fā)現(xiàn) α4β3和 α4β3δ 也是依托咪酯重要作用位點(diǎn)。對人胚胎腎細(xì)胞（HEK）轉(zhuǎn)染和電生理記錄，發(fā)現(xiàn)α4β3和 α4β3δ 位點(diǎn)僅有較弱的 GABA 效應(yīng)，但是增加 α4/6β3δ 和α4β3位點(diǎn)的GABA效應(yīng)后可能會增強(qiáng)依托咪酯的麻醉作用[18]。

3 小結(jié)

綜上所述，丙泊酚、依托咪酯的麻醉作用和GABAA受體密切相關(guān)。小劑量的丙泊酚和依托咪酯可以增強(qiáng)GABA與GABAA受體的親和力，中劑量直接興奮GABAA受體。α和β亞單位被認(rèn)為是這兩種麻醉藥的作用位點(diǎn)，但是精確靶點(diǎn)尚不明確。隨著神經(jīng)電生理、分子生物學(xué)以及細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)的不斷完善，丙泊酚和依托咪酯的麻醉作用機(jī)制會逐步清晰。

[1]Bormann J,The'ABC'of GABA receptors[J].Trends Pharmacol Sci,2000,21(1)：16-19.

[2]Jonsson Fagerlund M,Sjodin J,Krupp J,et al.Reduced effect of propofol at human{alpha}1{beta}2(N289M){gamma}2 and{alpha}2{beta}3(N290M){gamma}2 mutant GABA(A)receptors[J].Br J Anaesth,104(4)：472-481.

[3]Franks NP.General anaesthesia：from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal[J].Nat Rev Neurosci,2008,9(5)：370-386.

[4]Hara M,Kai Y,Ikemoto Y,Enhancement by propofol of the gammaaminobutyric acidA response in dissociated hippocampal pyramidal neurons of the rat[J].Anesthesiology,1994,81(4)：988-994.

[5]Ying SW,Goldstein PA.Propofol suppresses synaptic responsiveness of somatosensory relay neurons to excitatory input by potentiating GABA(A)receptor chloride channels[J].Mol Pain,2005,1：2.

[6]Buggy DJ,Nicol B,Rowbotham DJ,et al.Effects of intravenous anesthetic agents on glutamate release：a role for GABAAreceptor-mediated inhibition[J].Anesthesiology,2000,92(4)：1067-1073.

[7]Orser BA,Wang LY,Pennefather PS,et al.Propofol modulates activation and desensitization of GABAAreceptors in cultured murine hippocampal neurons[J].J Neurosci,1994,14(12)：7747-7760.

[8]Antkowiak B.Different actions of general anesthetics on the firing patterns of neocortical neurons mediated by the GABA(A)receptor[J].Anesthesiology,1999,91(2)：500-511.

[9]Vanlersberghe C,Camu F.Etomidate and other non-barbiturates[J].Handb Exp Pharmacol,2008,(182)：267-282.

[10]Tomlin SL,Jenkins A,Lieb WR,et al.Stereoselective effects of etomidate optical isomers on gamma-aminobutyric acid type A receptors and animals[J].Anesthesiology,1998,88(3)：708-717.

[11]Belelli D,Lambert JJ,Peters JA,et al.Whiting,the interaction of the general anesthetic etomidate with the gamma-aminobutyric acid type A receptor is influenced by a single amino acid[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,94(20)：11031-11036.

[12]Li GD,Chiara DC,Sawyer GW,et al.Identification of a GABAAreceptor anesthetic binding site at subunit interfaces by photolabeling with an etomidate analog[J].J Neurosci,2006,26(45)：11599-11605.

[13]Proctor WR,Mynlieff M,Dunwiddie TV.Facilitatory action of etomidate and pentobarbital on recurrent inhibition in rat hippocampal pyramidal neurons[J].J Neurosci,1986,6(11)：3161-3168.

[14]Yang J,Uchida I.Mechanisms of etomidate potentiation of GABAAreceptor-gated currents in cultured postnatal hippocampal neurons[J].Neuroscience,1996,73(1)：69-78.

[15]O'Meara GF,Newman RJ,Fradley RL,et al.The GABA-A beta3 subunit mediates anaesthesia induced by etomidate[J].Neuroreport,2004,15(10)：1653-1656.

[16]Zeller A,Arras M,Lazaris A,et al.Rudolph,Distinct molecular targets for the central respiratory and cardiac actions of the general anesthetics etomidate and propofol[J].FASEB J,2005,19(12)：1677-1679.

[17]Cheng VY,Martin LJ,Elliott EM,et al.Alpha5GABAA receptors mediate the amnestic but not sedative-hypnotic effects of the general anesthetic etomidate[J].J Neurosci,2006,26(14)：3713-3720.

[18]Meera P,Olsen RW,Otis TS,et al.Etomidate,propofol and the neurosteroid THDOC increase the GABA efficacy of recombinant alpha4beta3delta and alpha4beta3 GABA A receptors expressed in HEK cells[J].Neuropharmacology,2009,56(1)：155-160.