基于硫醇自組裝的肌紅蛋白單克隆抗體金膜固相載體的構(gòu)建

雷博，曲炳郡，楊華，張向穎，劉芳

1 清華大學(xué)微電子學(xué)研究所，北京 100084

2 北京市肝病研究所，北京 100069

心肌梗塞發(fā)病死亡率高，嚴(yán)重危害身體健康。肌紅蛋白 (Mb) 是人體橫紋肌組織所特有的一種蛋白質(zhì)，在正常人血清的含量甚微，約為60 μg/L。當(dāng)心肌和骨骼肌受損時(shí)，從受損的肌細(xì)胞釋放出來，濃度升高。研究表明，心肌梗塞患者的血清 Mb濃度在發(fā)病早期 (6~24 h) 達(dá)到100~300 μg/L，在發(fā)病后期 (48 h后) Mb濃度下降到60 μg/L[1]。大量的臨床實(shí)驗(yàn)表明，Mb作為心肌梗塞的早期診斷指標(biāo)，具有較高的靈敏度，但由于骨骼肌受損后 Mb濃度同樣會升高，故特異性不強(qiáng)，Mb與其他指標(biāo) (cTnI、CK-MB) 聯(lián)合，可提高心肌梗塞診斷的特異性[2-3]。

檢測 Mb的方法主要有酶聯(lián)免疫法 (ELISA)、熒光標(biāo)記法、化學(xué)發(fā)光法等。這些方法依靠體積龐大、價(jià)格昂貴的光學(xué)檢測系統(tǒng)；檢測時(shí)間長，需要數(shù)小時(shí)以上；由于存在人工操作，批內(nèi)和批間差異顯著。這些因素限制了心肌梗塞早期診斷的快速、高效和準(zhǔn)確進(jìn)行。近年來，一種新型的磁電阻生物傳感器成為研究熱點(diǎn)，這種傳感器通過在生物分子上標(biāo)記磁球，用磁傳感器來間接檢測生物分子。由于應(yīng)用了微流體技術(shù)、磁電子技術(shù)、微加工技術(shù)和生物技術(shù)，該傳感器的靈敏度可達(dá)到 pg/L水平、樣本體積僅為幾個(gè) μL，檢測時(shí)間縮短到半小時(shí)以內(nèi)、全程操作自動化，比傳統(tǒng)的檢測方法有重大提高。美國的海軍實(shí)驗(yàn)室、斯坦福大學(xué)，以及中國的清華大學(xué)、電子科技大學(xué)等國內(nèi)外機(jī)構(gòu)開展了此項(xiàng)研究[4-8]。這種生物傳感器有望應(yīng)用于心肌梗塞早期診斷，顯著提高診斷水平。

將抗體固定在載體表面是實(shí)現(xiàn)傳感器對抗原檢測的關(guān)鍵一步，現(xiàn)有固定方法分為物理吸附法和化學(xué)偶聯(lián)法[9]。物理吸附法利用載體和抗體之間的電荷作用、疏水作用、范德華力等作用將抗體固定在載體上。目前廣泛采用的 ELISA、熒光標(biāo)記等方法都是使用物理吸附法，但存在抗體吸附不牢固、非特異性等問題?；瘜W(xué)偶聯(lián)法通過化學(xué)鍵將抗體固定在載體上，在固定前需要通過化學(xué)方法修飾載體，常見的修飾試劑有戊二醛、瓊脂糖、硫醇和聚賴氨酸等[10-12]。化學(xué)偶聯(lián)法比物理吸附法能固定的抗體多并且牢固，有可能大大提高檢測靈敏度，且大大減少了因物理吸附而導(dǎo)致的非特異反應(yīng)，因而有更好的特異性。本研究采用了化學(xué)偶聯(lián)的方法。

自組裝膜具有分子生長致密度高、生長條件簡單的特點(diǎn)，已應(yīng)用于抗體在生物傳感器表面的固定。硫原子和貴金屬 (如Au、Ag和Pt) 具有很強(qiáng)的相互作用力，各種含硫分子，如二硫化物 (R-SS-R)、硫化物和硫醇類，可在貴金屬表面形成高度有序且密切排列的自組裝膜[13-17]。

本研究室前期已經(jīng)制備了磁電阻生物傳感器的芯片[8]，傳感器的表面是一層金膜，厚度為60 nm，需要進(jìn)一步研究如何將肌紅蛋白抗體 (MbAb) 偶聯(lián)在傳感器表面。文獻(xiàn)[18]報(bào)道了在磁電阻生物傳感器上利用硫醇自組裝固定抗體的方法，但沒有對固定過程進(jìn)行優(yōu)化。本研究著重于固定過程的優(yōu)化，用硫醇自組裝的方法構(gòu)建 Mb單克隆抗體的金膜固相載體，借助辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的IgG和BCA試劑盒測定偶聯(lián)在固相載體上的MbAb量和偶聯(lián)效率，并測定已偶聯(lián)抗體的載體對不同濃度抗原的免疫活性。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Mb抗原 (MbAg)、MbAb (Hytest公司)，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、HRP標(biāo)記山羊抗人IgG (鼎國昌盛生物技術(shù)公司)，牛血清白蛋白 (BSA) (Roche公司)，巰基11酸 (化學(xué)式C11H22O2S)、巰基16酸(化學(xué)式C16H32O2S)、巰基11醇 (化學(xué)式C11H24OS) (Sigma公司)，顯色液 (萬泰生物藥業(yè)公司)，BCA試劑盒 (博奧森生物技術(shù)公司)，其余試劑 (國產(chǎn)，分析純)，酶標(biāo)板 (Costar公司)，酶標(biāo)儀Model 680 (BIO-RAD公司)，清華大學(xué)物理系 NanoScope Ⅲ型原子力顯微鏡 (AFM)，清華大學(xué)分析中心 PHI Quantera SXM型X射線光電子能譜儀 (XPS)，清華-富士康納米中心蒸發(fā)儀。

1.2 MbAb金膜載體的制備

1.2.1 金膜載體制備

4英寸硅片蒸發(fā)薄膜Cr (10 nm)/Au (60 nm)，切割成4 mm×4 mm的正方形。依次用無水乙醇和去離子水超聲清洗5 min。

1.2.2 金膜載體生長硫醇自組裝膜

用無水乙醇配置羧基硫醇 (巰基11酸或巰基16酸) 和羥基硫醇 (巰基 11醇) 一定濃度的混合溶液。將金膜硅片放入酶標(biāo)孔中，每孔加入100 μL溶液，置于烘箱 (溫度可設(shè))、室溫 (25 ℃) 或冰箱(?20 ℃或4 ℃) 中，一定時(shí)間后取出，再依次用無水乙醇、乙酸/無水乙醇 (10%，V/V)、無水乙醇漂洗。硫醇的硫原子和金膜的金原子形成金/硫共價(jià)鍵，硫醇分子的羧基和羥基裸露在另一端，形成一層混合自組裝膜。

1.2.3 硫醇自組裝膜的AFM和XPS分析

已生長硫醇自組裝膜的金膜硅片在 AFM 和XPS下觀測。AFM的觀察范圍為1 μm×1 μm，使用敲擊模式。XPS分析全譜和硫元素的S2p譜。

1.2.4 金膜載體羧基活化

加入EDC·HCl的乙磺酸 (MES) (0.1 mol/L，pH 6.0) 溶液，EDC·HCl的濃度為4 g/L，避光，室溫水浴反應(yīng)30 min，用磷酸鹽緩沖溶液 (PBS，0.01 mol/L，pH 7.4) 洗 5次。硫醇的羧基和EDC·HCl發(fā)生反應(yīng)。

1.2.5 抗體偶聯(lián)和偶聯(lián)效率的測定

加入一定濃度的MbAb的PBS溶液，室溫水浴反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后吸取剩余液體，用已知濃度的MbAb作為標(biāo)準(zhǔn)液，加入BCA工作液，用酶標(biāo)儀測量OD562值，計(jì)算偶聯(lián)效率。計(jì)算公式如下：

1.2.6 金膜載體封閉

加入BSA濃度為5 g/L的PBS溶液，37 ℃水浴1 h，用磷酸鹽吐溫 (PBST) 溶液 (PBS溶液加入0.5% Tween-20，V/V) 洗5次。

1.2.7 抗體偶聯(lián)量的測定

加入工作濃度的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，PBST洗5次，加入TMB底物顯色8 min，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長處測量OD值。以未固定MbAb的金膜硅片作為陰性對照。

1.2.8 偶聯(lián)抗體免疫活性測定

將一定濃度的MbAb偶聯(lián)在金膜硅片上，放入已封閉的酶標(biāo)孔中，配置 7組濃度的肌紅蛋白抗原溶液 (30、75、120、165、210、255、300 μg/L)，作為陽性對照，PBS溶液作為陰性對照，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，PBST洗5次，加入工作濃度的HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG，37 ℃水浴反應(yīng)1 h，加入TMB底物顯色8 min，以2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，在450 nm波長處測量OD值。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，差異的顯著性用線性回歸分析檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

MbAb在金膜載體上固定的反應(yīng)過程如圖 1所示，包括硫醇自組裝、EDC活化和抗體偶聯(lián)3個(gè)步驟。硫醇的生長溫度、濃度、生長時(shí)間、硫醇種類；MbAb濃度和MbAb的偶聯(lián)時(shí)間等因素影響MbAb的固定效果。

2.1 硫醇生長溫度的影響

不同硫醇生長溫度的抗體偶聯(lián)量見圖 2。R=0.910，P=0.004＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。固定在金膜載體上的MbAb數(shù)量隨溫度升高先增大后減小，在80 ℃達(dá)到峰值。

圖1 金膜上固定MbAb的化學(xué)反應(yīng)過程Fig. 1 Chemical reaction process of immobilizing MbAb on gold.

圖2 不同硫醇生長溫度的抗體偶聯(lián)量Fig. 2 Antibody immobilized quantity at different growing temperature of thiol.

2.2 硫醇種類的影響

4組溶液：①巰基11酸；②巰基16酸；③巰基11酸和巰基11醇；④巰基16酸和巰基11醇。①②的硫醇濃度為0.5 mmol/L，③④的兩種混合硫醇的濃度均為0.5 mmol/L。表1表明，巰基16酸和巰基11醇作為硫醇溶液時(shí)，固定的MbAb抗體量最大。

2.3 硫醇濃度的影響

以50 mmol/L的巰基16酸和巰基11醇為起始濃度，5倍連續(xù)稀釋，分為7組。圖3表明，硫醇濃度增大，固定的MbAb數(shù)量增大，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇50 mmol/L的硫醇濃度。R=0.919，P=0.003＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 硫醇種類對MbAb固定的影響Table 1 Effect of thiol type on MbAb immobilization

圖3 不同硫醇濃度的抗體偶聯(lián)量Fig. 3 Antibody immobilized quantity at different thiol concentration.

2.4 硫醇生長時(shí)間影響

圖4表明，偶聯(lián)效率在1~3 h增加較快，在3~12 h增加較慢，故選擇3 h作為硫醇的生長時(shí)間。R=0.849，P=0.151＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 待偶聯(lián)的抗體濃度的影響

圖4 不同硫醇生長時(shí)間的偶聯(lián)效率Fig. 4 Coupling efficiency at different thiol growing time.

圖5 不同待偶聯(lián)抗體濃度對偶聯(lián)的影響Fig. 5 Effect of coupling at different antibody concentration.

圖5表明，偶聯(lián)效率隨著待偶聯(lián)的抗體濃度增大而減少；已偶聯(lián)的抗體濃度隨著待偶聯(lián)的抗體濃度增大先增大再減小，在60~80 mg/L達(dá)到峰值。圖 5的偶聯(lián)效率的統(tǒng)計(jì)分析表明，R=0.930，P=0.007＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 抗體偶聯(lián)時(shí)間的影響

圖6表明，偶聯(lián)效率在 1~3 h增加很快，在3~15 h增加緩慢。選擇優(yōu)化后的偶聯(lián)時(shí)間為3 h。R=0.675，P=0.325＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 硫醇自組裝膜的AFM分析結(jié)果

2.2 節(jié)中的②和④兩組硫醇自組裝膜 (未固定MbAb) 在AFM下觀察，結(jié)果如圖7所示。從截面圖看，兩種硫醇混合物 (巰基16酸和巰基11醇) 的自組裝膜的平整度優(yōu)于一種硫醇 (巰基16酸) 的自組裝膜的平整度。

2.8 硫醇自組裝膜的XPS分析結(jié)果

圖8是巰基11酸自組裝膜的金膜載體的XPS分析結(jié)果。溶液濃度為 0.5 mmol/L，反應(yīng)溫度為60 ℃，反應(yīng)時(shí)間為3 h，尚未固定MbAb。硫元素在碳、氧、硫三種元素的原子數(shù)的百分含量為6.14%，根據(jù)巰基11酸的化學(xué)式計(jì)算，硫原子數(shù)的百分含量為7.14%，二者接近，說明金膜表面結(jié)合有巰基11酸。S2p譜表現(xiàn)為單峰曲線。

2.9 金膜載體上MbAb的免疫活性測定

圖9是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后的金膜載體上的 MbAb的免疫活性測定結(jié)果。在血清 Mb濃度為正常值(30~75 μg/L) 和異常值 (100~300 μg/L) 時(shí)，載體都有較好的免疫反應(yīng)。線性回歸分析表明，R=0.985，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。測定表明，偶聯(lián)效率平均值為31.4%，標(biāo)準(zhǔn)差為7.3%。

圖6 不同偶聯(lián)時(shí)間的偶聯(lián)效率Fig. 6 Coupling efficiency at different coupling time.

圖7 硫醇自組裝膜的原子力顯微鏡觀察結(jié)果Fig. 7 Atomic force microscopy observation of thiol SAMs. The upper figures are the top view. The lower figures are the section view. (A) Observation result of homogeneous thiol (mercapto hexadecanoic acid, C16H32O2S). (B) Observation result of mixed thiol (mercapto hexadecanoic acid C16H32O2S and mercapto undecanol C11H24OS).

圖8 硫醇 (巰基11酸) 自組裝膜的X射線光電子能譜觀察結(jié)果Fig. 8 X-ray photoelectron spectroscopy observation of thiol SAMs of mecapto undercanoic acid (C11H22O2S). (A) The whole energy spectrum of the sample. (B) The subtle energy spectrum S2p of sulfur element of the sample.

圖9 偶聯(lián) MbAb的金膜載體對不同濃度抗原的免疫活性Fig. 9 Immunocompetence of MbAb immobilized on gold film for antigen of different concentration.

3 討論

硫醇生長溫度實(shí)驗(yàn)表明，80 ℃是硫醇自組裝膜生長的最佳溫度，但 80 ℃時(shí)溶劑乙醇蒸發(fā)速度加快，導(dǎo)致在自組裝膜生長完成前溶劑乙醇已經(jīng)蒸發(fā)完畢，并且高溫可能損壞傳感器，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇60 ℃作為硫醇自組裝膜的生長溫度。

溫度影響硫醇自組裝膜生長，其機(jī)理解釋如下：硫醇分子在金膜表面有金/硫共價(jià)鍵形成、斷裂；物理吸附和物理解吸附 4個(gè)子過程，這 4個(gè)子過程共同決定了自組裝膜的密度，不同溫度范圍起決定作用的子過程不同。Chandekar等[19]研究了巰基16酸/金自組裝膜的熱穩(wěn)定性，將生長好的自組裝膜樣品放置在25 ℃ ~240℃的真空加熱箱中。結(jié)果表明，110 ℃時(shí)，部分金硫鍵發(fā)生斷裂，但物理解吸附作用微弱，金/硫鍵可能再次成鍵；超過150 ℃后，大部分金/硫鍵斷裂，同時(shí)物理解吸附作用增強(qiáng)，金硫鍵斷裂后無法再次成鍵，150 ℃是巰基16酸/金自組裝膜穩(wěn)定的極限溫度。本文的研究結(jié)果 (圖2) 表明，100 ℃時(shí)比80 ℃時(shí)偶聯(lián)在金膜載體上的抗體量減小，高溫導(dǎo)致自組裝膜金/硫共價(jià)鍵斷裂，這與文獻(xiàn)[19]結(jié)果一致。Li等[14]研究結(jié)果表明，70 ℃時(shí)，硫醇/金自組裝膜的致密度比?18 ℃和22 ℃更高，更多的蛋白質(zhì)被固定。綜上所述，在較低溫度范圍 (?20 ℃~80 ℃)，硫原子和金原子隨著溫度升高，內(nèi)能增大而成鍵幾率增大，成鍵過程起主要作用，自組裝膜密度增大；而在高溫范圍 (80 ℃ ~240℃)，金/硫共價(jià)鍵斷裂起主要作用，自組裝膜密度減小。

硫醇種類實(shí)驗(yàn)表明，巰基酸和巰基醇的混合溶液固定抗體的效果好于單一巰基酸溶液的固定效果；巰基16酸的固定效果好于巰基11酸的固定效果。故選擇巰基16酸和巰基11醇作為組合。

硫醇種類影響抗體固定效果從本質(zhì)上是因?yàn)榱虼挤肿拥墓倌軋F(tuán)和碳鏈長度的影響。含羥基和羧基官能團(tuán)的混合硫醇，羧基電離后，裸露的氧原子會爭奪羥基的氫原子，形成氫鍵，因此，含羥基硫醇的自組裝膜的結(jié)構(gòu)排布更有序，更容易在EDC的催化下和抗體反應(yīng)。Nikin等[15]認(rèn)為，混合硫醇比單一硫醇有更好的固定效果，是由于混合硫醇的輸水性作用更強(qiáng)。文獻(xiàn)[17]表明，混合硫醇的兩種分子數(shù)比為1∶1時(shí)，自組裝膜的致密度最高，固定的蛋白質(zhì)最多。另一方面，當(dāng)硫醇分子的碳鏈增長時(shí)，更多的硫醇分子的碳鏈保持直立狀態(tài)[14]，末端羧基暴露在外部，和EDC的反應(yīng)幾率增大。

待偶聯(lián)的抗體濃度實(shí)驗(yàn)表明，偶聯(lián)效率隨待偶聯(lián)的抗體濃度的增大而降低 (圖 5)，這是因?yàn)榻鹉け砻娴牧虼济芏扔邢?，所能固定的抗體量有限；另一個(gè)原因是抗體溶液濃度增大，溶液中的抗體分子撞擊已偶聯(lián)的抗體分子，破壞酰胺鍵，導(dǎo)致偶聯(lián)失效。在10~80 mg/L的范圍內(nèi)，抗體濃度增大，接近所能固定的抗體量的極限?？贵w濃度為100 mg/L時(shí)比80 mg/L時(shí)固定的抗體量減小，可能因?yàn)榭贵w分子的撞擊作用進(jìn)一步增強(qiáng)，導(dǎo)致所能固定的抗體量進(jìn)一步下降。雖然80 mg/L時(shí)固定的MbAb數(shù)量最大，但考慮到試劑成本因素，選擇優(yōu)化后的濃度為40 mg/L。

對硫醇自組裝膜的XPS分析表明，硫元素的S2p能譜只有一個(gè)峰，這和參考文獻(xiàn)[14]中硫元素的 S2p能譜一致。如果有2個(gè)峰出現(xiàn)，則有部分硫醇分子物理吸附在金膜表面，不是共價(jià)鍵結(jié)合。

含羧基的硫醇分子在EDC的催化下，和抗體的賴氨酸殘基 (含氨基) 發(fā)生反應(yīng)，將抗體固定在金膜表面，反應(yīng)位點(diǎn)決定于抗體的賴氨酸殘基的位置。文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，聚賴氨酸和戊二醛對蛋白質(zhì)的偶聯(lián)效率高于硫醇，這是由于聚賴氨酸有雙官能團(tuán) (氨基和羧基)，而戊二醛有2個(gè)醛基，都可以和抗體發(fā)生偶聯(lián)。Xie等[20]報(bào)道了戊二醛作為偶聯(lián)劑在氨基化玻璃上偶聯(lián)丙肝單克隆抗體，偶聯(lián)效率達(dá)到85%。然而，硫醇偶聯(lián)的抗體的反應(yīng)活性高于聚賴氨酸和戊二醛[12]，即抗體的反應(yīng)活性較高，這可能與偶聯(lián)試劑的分子結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，更長的碳鏈有利于抗體和抗原結(jié)合。

抗體固定在金膜固相載體上后，需要加入封閉劑，以封閉已經(jīng)活化而未偶聯(lián)抗體的羧基，減少非特異性反應(yīng)，降低假陽性率。封閉液通常用含賴氨酸較多的封閉劑，選用5 g/L的BSA溶液。

總之，本研究通過硫醇自組裝的方法構(gòu)建了肌紅蛋白單克隆抗體的金膜固相載體，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，測定了偶聯(lián)抗體的免疫活性，對于面向心肌梗塞診斷的磁電阻生物傳感器的后續(xù)研究有重要參考價(jià)值。

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