畢赤酵母中表達(dá)透明顫菌血紅蛋白提高重組脂肪酶的表達(dá)

汪小鋒，孫永川，申旭光，柯鋒，徐莉，劉云，閆云君

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 教育部分子生物物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074

巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris具有強(qiáng)啟動(dòng)子、可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后加工與修飾、易于高密度發(fā)酵和純化等優(yōu)點(diǎn)[1]，是近年來(lái)廣泛報(bào)道的能高效表達(dá)各種外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，目前已有600多種蛋白在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)[2]。為了提高重組蛋白的體積生產(chǎn)率，工業(yè)上通常進(jìn)行高細(xì)胞密度發(fā)酵[3]。畢赤酵母高細(xì)胞密度發(fā)酵過(guò)程需要消耗大量的氧氣，通常會(huì)造成供氧限制。而氧氣在發(fā)酵液中的溶解度較低，且隨著發(fā)酵液中生物量和消泡劑的增加，其溶解度和傳質(zhì)效率還會(huì)逐步降低[4]，因此溶氧控制是畢赤酵母高密度發(fā)酵過(guò)程中影響重組蛋白表達(dá)的重要因素。在大規(guī)模發(fā)酵過(guò)程中由于大的發(fā)酵罐存在體積大、死角較多，罐內(nèi)各部位溶氧分布不均，導(dǎo)致低氧問(wèn)題十分突出[5]，因此利用分子生物學(xué)方法改善重組畢赤酵母在低氧條件下的蛋白表達(dá)水平意義十分重大。

透明顫菌血紅蛋白 (Vitreoscilla hemoglobin，VHb) 是一種專性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種分子量約為15.8 kDa的可溶性蛋白，具有較高的氧吸附和解離速率常數(shù)[6]，已在多種宿主中成功表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和提高代謝物產(chǎn)率[7]。在畢赤酵母中共表達(dá)目的蛋白和VHb是改善高密度發(fā)酵過(guò)程中溶氧限制的一種有效方式。在氧供應(yīng)正常的情況下，β-半乳糖苷酶與VHb在畢赤酵母中共表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有明顯促進(jìn)作用，但重組菌中 β-半乳糖苷酶的表達(dá)量提高了 4倍[3]。此外，有研究表明，VHb在畢赤酵母中的表達(dá)不僅能提高氧的利用率和 S-腺苷甲硫氨酸的產(chǎn)率，還能促進(jìn)ATP合成，增強(qiáng)甲醇代謝活性[4]。PsADH2啟動(dòng)子是一種來(lái)源于樹干畢赤酵母的乙醇脫氫酶2 (PsADH2)基因的低氧誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，能在氧氣限制條件下被激活。該啟動(dòng)子應(yīng)用于畢赤酵母中表達(dá)VHb能在低氧條件下改善重組細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]，提高重組植酸酶的表達(dá)量[5]。

YlLip2是一種重要的微生物脂肪酶，具有較高的水解、酯化和轉(zhuǎn)酯活力，在酯合成、生物柴油制備和對(duì)映體拆分等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。YlLip2已在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)了高水平的表達(dá)[10-12]，但高密度發(fā)酵過(guò)程中VHb與脂肪酶共表達(dá)的研究尚未見有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中，首先將YlLip2基因 (lip2) 克隆到pPIC9K載體中，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌株GS115，得到重組菌株GS115/9Klip2。利用重疊PCR的方法將PsADH2啟動(dòng)子和終止子與VHb基因 (vgb) 融合后單獨(dú)或與lip2基因共同整合到誘導(dǎo)型的 pPICZαA 表達(dá)載體中，電轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2菌株，實(shí)現(xiàn)VHb的胞內(nèi)表達(dá)與YlLip2的分泌表達(dá)。同時(shí)，在溶氧限制條件下對(duì)重組菌株的細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪酶的表達(dá)水平進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

pPIC9K-Lip2H和pMD-VHb質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。P. pastoris GS115 (his4)、pPIC9K、 pPICZαA和E. coli Top10均購(gòu)自Invitrogen公司。pMD18-T simple載體購(gòu)自日本 TaKaRa公司。Pichia stipitis CBS 6054由杭州師范大學(xué)李海峰博士饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑及儀器

胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司；YNB (無(wú)氨基酸) 購(gòu)自BD公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真 PrimerSTAR HS DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒等購(gòu)自TaKaRa公司；DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MGE公司；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；所有化學(xué)試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10 L攪拌式發(fā)酵罐 (BIOTECH-10JGZ) 購(gòu)自上海保興生物設(shè)備工程有限公司；GenePulserⅡ電穿孔儀購(gòu)自Bio-RAD公司；高速離心機(jī)和PCR儀均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；高壓細(xì)胞破碎儀購(gòu)自英國(guó)Constant Systems公司。

1.1.3 引物與培養(yǎng)基

根據(jù)NCBI公布的DNA序列設(shè)計(jì)引物 (表1)，所有普通 PCR引物均由上海生物工程公司合成。基因測(cè)序由上海桑尼生物科技有限公司完成。YPD、YPDS、BMGY、BMMY、MD、MM等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)。酶活力檢測(cè)采用BMMY-羅丹明B-橄欖油平板 (100 mL的BMMY培養(yǎng)基中加入1 mL橄欖油乳化液和400 μL的0.1%的羅丹明B)；10 L發(fā)酵罐上采用修飾的FM22培養(yǎng)基[13](g/L)：KH2PO4，42.9；(NH4)2SO4，5；CaSO4，0.6；K2SO4，14.3；MgSO4·7H2O 11.7；檸檬酸，1.9；甘油，40 g和 2.0 mL/L的微量元素儲(chǔ)液PTM4[13]。發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油 50% (W/V，含 4 mL/L PTM4)；甲醇 100% (含 4 mL/L PTM4)。

表1 本文中所用到的引物Table 1 The Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以 pPIC9K-Lip2H的質(zhì)粒 DNA為模板，利用lip2-F1和lip2-R1為引物擴(kuò)增lip2基因，PCR產(chǎn)物加A后連接pMD18-T simple載體，形成的pMD-lip2質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化E. coli Top10，篩選陽(yáng)性克隆子并通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入基因的正確性。測(cè)序正確的pMD-lip2質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、膠回收后的目的基因片段插入到pPIC9K的EcoR Ⅰ/Not Ⅰ位點(diǎn)之間形成pPIC9K-lip2質(zhì)粒；重組質(zhì)粒pPIC9K-lip2經(jīng)Sal Ⅰ線性化后，取10 μg與80 μL的GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，在電轉(zhuǎn)參數(shù)為1 500 V、25 μF、200 ?的條件下轉(zhuǎn)化，得到GS115/9Klip2菌株。重組菌株的表型鑒定和高拷貝篩選參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)。將高 G418抗性的 Mut+型克隆子轉(zhuǎn)移到 BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取水解圈較大的克隆子進(jìn)行 PCR驗(yàn)證和酶活力篩選。脂肪酶活力最高的重組菌株將進(jìn)行下一步的有關(guān)研究。

以樹干畢赤酵母基因組 DNA為模板，分別以ADH2-P1/P2和 ADH2-T1/T2為引物擴(kuò)增 PsADH2啟動(dòng)子和終止子。以pMD-VHb質(zhì)粒DNA為模板，以VHb-M1和VHb-M2為引物擴(kuò)增vgb基因片段，通過(guò)重疊PCR的方法將PsADH2啟動(dòng)子和終止子與 vgb基因融合成一個(gè)完整的基因 PVT。PVT經(jīng)BamHⅠ酶切后膠回收的片段插入到 pPICZαA載體中得到pPICZPVT。以pPIC9K-lip2的質(zhì)粒DNA為模板，以lip2-F2和lip2-R2為引物擴(kuò)增lip2基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ/XbaⅠ雙酶切、膠回收后，整合到pPICZPVT載體中形成pPICZPVT-lip2質(zhì)粒。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒 pPICZPVT和 pPICZPVT-lip2構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒經(jīng) BstXⅠ線性化后電轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2，得到重組菌株 GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2-pZPVTlip2。采用YPDS-Zeocin抗性平板篩選高拷貝克隆子。將高Zeocin抗性的克隆子轉(zhuǎn)移到BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d后，挑取水解圈較大的克隆子進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶活力篩選。

1.2.2 高產(chǎn)菌株的篩選與搖瓶發(fā)酵

隨機(jī)挑取 60個(gè)水解圈較大的克隆子接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中，30 ℃、220 r/min下培養(yǎng)16~18 h，當(dāng)吸光度OD600=4~6時(shí)，離心收集菌體后轉(zhuǎn)移到50 mL的BMMY培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔24 h添加1.5% (V/V) 的甲醇，并取樣檢測(cè)生物量和發(fā)酵液上清的酶活力。對(duì)篩選到的高脂肪酶活力的重組菌株進(jìn)行發(fā)酵pH和甲醇添加量的優(yōu)化，為發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵提供一定的參考。

1.2.3 分批補(bǔ)料培養(yǎng)

將?80 ℃保存的克隆子接種到30 mL的YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后轉(zhuǎn)接到裝有400 mL BMGY培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，培養(yǎng)18~20 h，當(dāng)OD600=4~6時(shí)，以10%的接種量接入到起始裝液量為4 L FM22培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)。菌體生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段溫度分別設(shè)定為29 ℃和25 ℃，攪拌速度500~800 r/min，DO維持在10%~25%之間，通氣量維持在4~12 L/min，流加28%的氨水和 30%的磷酸自動(dòng)控制pH，菌體生長(zhǎng)階段和誘導(dǎo)階段分別為6.0和6.5。當(dāng)甘油耗盡后，補(bǔ)加400 mL 50%的甘油；當(dāng)DO再次上升后，流加100%甲醇至罐中的甲醇的濃度為 0.5%，0~6 h流加速度為1.5~3.5 mL/(L·h)，6~24 h，逐漸提高流加速度到6~8 mL/(L·h)，并一直維持該速度至發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵過(guò)程中根據(jù) DO的波動(dòng)適當(dāng)調(diào)節(jié)甲醇流速。每隔一段時(shí)間取樣測(cè)定菌體濕重、酶活力和蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 生物量和重組菌株遺傳穩(wěn)定性的測(cè)定

取5 mL發(fā)酵液至預(yù)先已稱重的離心管中，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，用無(wú)菌水洗滌細(xì)胞2次，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清后稱重，計(jì)算細(xì)胞濕重 (WCW)。取發(fā)酵罐中培養(yǎng)160 h的發(fā)酵液1 mL用無(wú)菌水適當(dāng)稀釋，取80 μL稀釋液涂布在YPD平板上，待平板上有菌落形成，用牙簽挑取100個(gè)單克隆到固體YPD-G418-Zeocin選擇培養(yǎng)基上，菌斑出現(xiàn)后統(tǒng)計(jì)雙抗平板上的菌斑數(shù)量，計(jì)算工程菌種質(zhì)粒的丟失率，重復(fù)操作3次。

1.2.5 VHb活力的檢測(cè)

VHb活性檢測(cè)采用 CO-差光譜法[8]。10 mL發(fā)酵液在5 000 r/min離心5 min后，細(xì)胞重懸于100 mmol/L的 Tris-HCl緩沖液 (pH 7.5，包含50 mmol/L NaCl)，高壓細(xì)胞破碎后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取3 mL上清用緩沖液稀釋1倍并加入連二亞硫酸鈉至終濃度為 2.5 mg/mL，通入 CO氣體室溫避光孵育3 min，用美譜達(dá)1800PC紫外可見分光光度計(jì)在400~500 nm波段掃描得到CO-差示光譜圖。

1.2.6 脂肪酶活力測(cè)定與蛋白質(zhì)分析

脂肪酶活性測(cè)定采用堿式滴定法[12]。操作步驟如下：酶活力測(cè)定以橄欖油乳化液 (橄欖油∶PVA=1∶3，V/V) 為底物，底物4 mL、Tris-HCl (pH 8.0，50 mmol/L) 5 mL和適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液1 mL組成10 mL反應(yīng)體系，40 ℃水浴反應(yīng)10 min后加入15 mL終止液 (乙醇∶丙酮＝1∶1，V/V) 終止反應(yīng)。酶催化水解產(chǎn)生的脂肪酸通過(guò)0.05 mol/L NaOH滴定測(cè)得，加兩滴0.5%酚酞指示滴定終點(diǎn)。在40 ℃、pH 8.0的條件下，脂肪酶每分鐘水解橄欖油產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶量定義為一個(gè)活力單位 (U)。蛋白濃度測(cè)定采用BCA蛋白濃度定量檢測(cè)試劑盒。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的分子量和表達(dá)水平，蛋白質(zhì)染色采用考馬斯亮藍(lán)R-250。

TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)畢赤酵母基因組中l(wèi)ip2基因的拷貝數(shù)由廣州吉坤生物技術(shù)有限公司完成。畢赤酵母GAP基因的標(biāo)準(zhǔn)品、lip2基因和GAP基因的引物、探針均由廣州達(dá)安基因公司提供。陽(yáng)性重組質(zhì)粒 pPICZαA-lip2和 pPIC3.5K-vgb作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，重組菌株的基因組 DNA作為模板，均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

去自身信號(hào)肽的lip2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為906 bp，PsADH2啟動(dòng)子和終止子與vgb基因通過(guò)重疊PCR的方法融合成全長(zhǎng)為1 383 bp的完整基因PVT，經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確后分別插入到 pPIC9K和pPICZαA 載體中，得到重組質(zhì)粒 pPIC9K-lip2和pPICZPVT。再將以lip2-F2和lip2-R2為引物擴(kuò)增得到 lip2基因插入到 pPICZPVT中，獲得重組質(zhì)粒pPICZPVT-lip2。通過(guò)PCR和測(cè)序證實(shí)所有的重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 高產(chǎn)菌株的篩選與搖瓶發(fā)酵

重組質(zhì)粒pPIC9K-lip2電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后得到重組菌株GS115/9Klip2。從BMMY-羅丹明B-橄欖油平板上隨機(jī)挑選 60個(gè)水解圈較大的Mut+型克隆子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。以 BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，篩選到一株最高脂肪酶水解活力為1 200 U/mL的克隆子GS115/9Klip2 58#。以該工程菌為基礎(chǔ)，考察了發(fā)酵pH和甲醇添加量對(duì)YlLip2表達(dá)量的影響 (圖1)。每24 h甲醇添加量為1.5% (V/V) 時(shí)，YlLip2的表達(dá)量最高 (圖1A)；脂肪酶的表達(dá)量隨初始誘導(dǎo)pH的增加而增加，當(dāng)pH為 6.5時(shí)達(dá)到最高，過(guò)高和過(guò)低的 pH都不利于 YlLip2的表達(dá) (圖 1B)。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo) pH采用 6.5，每 24 h甲醇添加量為 1.5% (V/V)。

pPICZPVT-lip2和 pPICZPVT經(jīng)BstXⅠ線性化后轉(zhuǎn)化 GS115/9Klip2 58#宿主，得到重組菌株GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2- pZPVTlip2?？蛰d質(zhì)粒pPICZαA轉(zhuǎn)化GS115/9Klip2 58#宿主得到一株陽(yáng)性克隆子 GS115/9Klip2-ZαA 9#作為對(duì)照菌株。以BMMY為誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h，重組菌株GS115/9Klip2-pZPVT和GS115/9Klip2-pZPVTlip2中的最高脂肪酶活力的克隆子28#和49#的YlLip2水解活力分別達(dá)到1 500 U/mL和4 000 U/mL。

圖1 不同的甲醇濃度和誘導(dǎo)pH對(duì)YlLip2產(chǎn)酶的影響Fig. 1 Effects of different methanol concentration (A) and induction pH values (B) on YlLip2 production.

2.3 VHb和YlLip2在畢赤酵母中的表達(dá)

提高搖瓶裝液量和降低轉(zhuǎn)速，創(chuàng)造 DO限制性條件，從而使低氧壓力啟動(dòng)子能啟動(dòng) vgb基因的表達(dá)。為了考察DO限制性條件下VHb和YlLip2在畢赤酵母中的表達(dá)情況，對(duì) 4個(gè)重組菌株(GS115/9Klip2 58#，GS115/9Klip2-ZαA 9#，GS115/ 9Klip2-pZPVT 28#，GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#)在搖瓶中的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，發(fā)酵條件為：裝液量100 mL/500 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min，誘導(dǎo)時(shí)間96 h。由于低氧壓力啟動(dòng)子啟動(dòng)vgb表達(dá)效率不高，VHb在胞內(nèi)的表達(dá)量不高，因此一般采用CO-差式光譜法檢測(cè)VHb是否實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。由圖2可知，VHb+細(xì)胞 (GS115/9Klip2-pZPVT 28#) 在420 nm附近有典型的特征吸收峰，而 VHb–細(xì)胞 (GS115/ 9Klip2 58#) 在420 nm處沒有特征吸收峰，說(shuō)明胞內(nèi)表達(dá)出了具有生物活性的VHb蛋白。

對(duì)以上菌株在 DO限制性發(fā)酵條件下的發(fā)酵液上清和細(xì)胞破碎液進(jìn)行SDS-PAGE分析 (圖3)。表達(dá)了VHb的重組菌株的發(fā)酵液上清中均有一條明顯的分子量大約為38 kDa的蛋白，與Y. lipolytica野生菌產(chǎn)生的YlLip2的分子量大小相當(dāng)。

在低氧條件下，對(duì)照菌株 GS115/9Klip2 58#和GS115/9Klip2-ZαA 9#的表達(dá)量都很低，而 GS115/ 9Klip2-pZPVT 28#和GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#表達(dá)量較高。

記錄兩組產(chǎn)婦麻醉起效時(shí)間、至胎兒娩出時(shí)間,針刺法測(cè)定兩組產(chǎn)婦最高阻滯平面,用VAS法評(píng)價(jià)兩組患者鎮(zhèn)痛指數(shù),分?jǐn)?shù)越高,鎮(zhèn)痛效果越好。

圖3 SDS-PAGE分析YlLip2在畢赤酵母中的表達(dá)Fig. 3 SDS-PAGE analysis of YlLip2 expressed in P. pastoris. M: protein marker; 1?4: 4 μL of culture supernatant of GS115/9Klip2 58#, GS115/9Klip2-ZαA 9#, GS115/9Klip2-pZPVT 28#, GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#; 5?8: 5 μL cell homogenates of GS115/9Klip2 58#, GS115/9Klip2-ZαA 9#, GS115/9Klip2-pZPVT 28#, GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#.

2.4 VHb對(duì)重組細(xì)胞的生長(zhǎng)和 YlLip2表達(dá)的影響

考察了搖瓶中VHb的表達(dá)對(duì)VHb+轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌株生長(zhǎng)和YlLip2表達(dá)的影響。由圖4可知，VHb的表達(dá)對(duì)重組菌的生長(zhǎng)沒有明顯促進(jìn)作用，但能提高YlLip2的表達(dá)量。VHb+細(xì)胞中YlLip2的表達(dá)量與VHb–細(xì)胞和對(duì)照菌株GS115/9Klip2-ZαA 9#相比分別提高了25%和36%。GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子中YlLip2的表達(dá)量與VHb+細(xì)胞相比得到了顯著提高。TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子基因組中l(wèi)ip2基因有8個(gè)拷貝，而VHb+細(xì)胞的基因組中只有4個(gè)拷貝，因此拷貝數(shù)的增加導(dǎo)致了YlLip2的表達(dá)量進(jìn)一步提高。

2.5 VHb對(duì)高密度發(fā)酵生產(chǎn)YlLip2的影響

為了考察低氧條件下VHb的表達(dá)對(duì)高密度發(fā)酵生產(chǎn)YlLip2的影響，DO和轉(zhuǎn)速采取串級(jí)控制以維持DO在10%~25%之間。由圖5可知，在高密度發(fā)酵過(guò)程中，VHb的表達(dá)不僅促進(jìn)了 VHb+細(xì)胞的生長(zhǎng)，也顯著提高了YlLip2在VHb+細(xì)胞中的表達(dá)量。

經(jīng)過(guò) 153 h的培養(yǎng)，VHb+細(xì)胞分泌表達(dá)的YlLip2活力達(dá)到最大，為15 900 U/mL，是VHb–細(xì)胞的 1.83倍。同時(shí)對(duì) VHb+轉(zhuǎn)化子 GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#在低氧條件下的高密度發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究 (圖 6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)YlLip2的表達(dá)量得到了進(jìn)一步的提高，經(jīng)過(guò)143 h的培養(yǎng)，YlLip2最高活力達(dá)到33 900 U/mL，總蛋白質(zhì)含量最高達(dá)到6.79 g/L。另外，考察了GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株在不同DO限制性條件下表達(dá)YlLip2的水平 (圖7)，發(fā)現(xiàn)在溶氧受限的情況下該工程菌也能獲得較高的表達(dá)量，但隨著溶氧濃度的降低，YlLip2的表達(dá)量也隨之降低。

圖4 甲醇誘導(dǎo)96 h后VHb+轉(zhuǎn)化子和對(duì)照菌株生物量和脂肪酶活力的對(duì)比Fig. 4 Comparison of biomass and lipase activity between VHb+ transformants and control strains after 96 h methanol induction. 1: GS115/9Klip2 58#; 2: GS115/9Klip2-ZαA 9#; 3: GS115/9Klip2-pZPVT 28#; 4: GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#. WCW: wet cell weight.

圖5 VHb+和VHb?細(xì)胞在DO受限的高密度發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)和脂肪酶活力的對(duì)比Fig. 5 Comparison of cell growth and lipase activity between VHb+ and VHb? cells under limiting DO condition during high cell density fermentation. WCW: wet cell weight.

3 討論

YlLip2是目前已報(bào)道的脂肪酶中蛋白表達(dá)量較高的脂肪酶之一，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。為了降低該脂肪酶的生產(chǎn)和應(yīng)用成本，加快其產(chǎn)業(yè)化，許多研究致力于通過(guò)分子生物學(xué)的方法和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化策略提高其表達(dá)量[10-11,14-15]。傳統(tǒng)的誘變育種和同源表達(dá)已有效提高了YlLip2的表達(dá)量[14-15]，脂肪酶最高的活力達(dá)到10 000 U/mL[15]。由于Y. lipolytica基因組中有多個(gè)脂肪酶基因[11]，盡管分泌到胞外的脂肪酶主要是YlLip2，但用野生菌株生產(chǎn)很難保證得到的脂肪酶是單一脂肪酶。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來(lái)應(yīng)用十分廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，在畢赤酵母中異源表達(dá)YlLip2能獲得更高的表達(dá)量，并且能得到純度較高的單一脂肪酶，發(fā)酵工藝控制較為簡(jiǎn)單，總的生產(chǎn)成本也相對(duì)較低。當(dāng)采用橄欖油為底物的堿滴定法測(cè)定脂肪酶活力時(shí)，Yu等[12]報(bào)道畢赤酵母中表達(dá)重組的YlLip2的最高活力為11 000 U/mL。本研究中獲得的GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#轉(zhuǎn)化子的最高酶活力達(dá)到33 900 U/mL，明顯高于Yu等[11-12]和 Turki等[15]的報(bào)道，并且該工程菌的遺傳穩(wěn)定性較好，經(jīng)過(guò) 196 h的培養(yǎng)，重組質(zhì)粒保存率為99.7%。

畢赤酵母高密度發(fā)酵大量表達(dá)外源蛋白時(shí)通常會(huì)引起溶氧的限制，若發(fā)酵罐的供氧不足就會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甲醇及其代謝副產(chǎn)物的積累，最終導(dǎo)致蛋白表達(dá)量的下降。改善溶氧限制的方法很多，主要包括提高攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、罐壓、調(diào)節(jié)甲醇補(bǔ)料速率、降低溫度、降低發(fā)酵液粘度、通空氣與純氧的混合氣、培養(yǎng)基中添加氧載體等[16]。但以上方法都不能從根本上解決溶氧限制的問(wèn)題，也無(wú)法解決大規(guī)模發(fā)酵罐中由于溶氧分布不均而導(dǎo)致的低氧問(wèn)題，并且會(huì)間接增加發(fā)酵過(guò)程的成本。因此，在工程菌中引入透明顫菌血紅蛋白共表達(dá)的方法，能有效提高重組細(xì)胞對(duì)氧的利用率、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、改善細(xì)胞的表達(dá)量、降低發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力成本。應(yīng)用AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)VHb有效促進(jìn)了外源蛋白的表達(dá)[3-4]，但應(yīng)用低氧壓力啟動(dòng)子 PsADH2表達(dá)VHb也能改善重組細(xì)胞的生長(zhǎng)[8]，提高外源蛋白的表達(dá)量[5]，并且對(duì)改善重組細(xì)胞的呼吸代謝具有其獨(dú)特性。細(xì)胞在溶氧正常的情況下VHb不表達(dá)，不影響重組細(xì)胞的正常代謝，在低氧的情況下啟動(dòng)VHb的表達(dá)，可提高細(xì)胞對(duì)氧的利用、改善細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而提高外源蛋白的表達(dá)。但 DO限制性條件下VHb對(duì)重組細(xì)胞攝氧的改善作用也是有限的，一定的范圍內(nèi) (5%~20%) 對(duì)重組細(xì)胞表達(dá)外源蛋白不會(huì)產(chǎn)生較大的影響，但過(guò)低的溶氧濃度依然會(huì)對(duì)VHb+細(xì)胞產(chǎn)生不利的影響 (圖7)。

圖6 GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株在10 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)YlLip2的脂肪酶活力、生物量和總蛋白濃度的過(guò)程變化曲線Fig. 6 Time course of lipase activity, biomass and total protein concentration during the production of YlLip2 using GS115/ 9Klip2-pZPVTlip2 49# strain in a 10-L fermentor. WCW: wet cell weight.

圖7 不同 DO限制性條件對(duì) GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#菌株表達(dá)YlLip2的影響Fig. 7 Effect of different limiting DO levels on YlLip2 production by GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49# strain.

本研究中成功構(gòu)建了VHb的胞內(nèi)表達(dá)和YlLip2胞外分泌表達(dá)的重組工程菌株，vgb和 lip2基因的表達(dá)分別通過(guò)PsADH2和AOX1啟動(dòng)子調(diào)控。在搖瓶發(fā)酵中，VHb在低氧條件下的表達(dá)對(duì)重組菌的生長(zhǎng)沒有明顯的促進(jìn)作用，但使YlLip2的表達(dá)量提高了大約25%。這與VHb同植酸酶在P. pastoris中的共表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，而植酸酶的表達(dá)量得到提高的結(jié)果相類似[5]。搖瓶中溶氧測(cè)定困難，無(wú)法獲知搖瓶中溶氧的限制程度，可能是由于搖瓶中氧的濃度過(guò)低導(dǎo)致 VHb+細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到一定抑制。10 L發(fā)酵罐中的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了低氧條件下VHb的表達(dá)改善了VHb+細(xì)胞的生長(zhǎng)，提高了YlLip2的表達(dá)量，因此有效改善了發(fā)酵罐中溶氧的限制，也間接降低了發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力成本。本研究中獲得的一株含有 8個(gè) lip2基因拷貝的 VHb+轉(zhuǎn)化子GS115/9Klip2-pZPVTlip2 49#，在低氧的高密度發(fā)酵過(guò)程中YlLip2的最高活力達(dá)到33 900 U/mL，明顯高于Yu等[10-11]在溶氧正常條件下單獨(dú)表達(dá)lip2基因獲得的YlLip2的表達(dá)量，為該脂肪酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。因此，基于以上結(jié)果，我們認(rèn)為PsADH2啟動(dòng)子調(diào)控下的vgb基因與其他工業(yè)酶基因在畢赤酵母中的共表達(dá)將能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、提高外源蛋白的表達(dá)量，這種策略具有重要的應(yīng)用前景。

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