10味中藥對畜禽大腸桿菌的體外抗菌活性試驗

郎利敏，王克領(lǐng)，張立憲，張青嫻，游 弋

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州農(nóng)業(yè)路1號450002）

大腸桿菌可引起多種畜禽疫病，臨床最常見的有仔豬黃、白痢，仔豬水腫病，雞的敗血癥、心包炎、肝周炎、腹膜炎、腸炎，家兔的黏液性腸炎等[1]。大腸桿菌病目前在國內(nèi)大多數(shù)養(yǎng)殖場廣泛流行，發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，臨床上主要還是使用抗生素藥物來控制大腸桿菌病，由于廣泛、大量、長期不規(guī)范的使用抗生素而導(dǎo)致大腸桿菌的耐藥性越來越嚴(yán)重，防治效果越來越差，并導(dǎo)致藥物殘留和一些藥源性疾病，嚴(yán)重威脅著動物源性食品安全和公共衛(wèi)生[2]。而一些中草藥具有抗菌、消炎、不易產(chǎn)生耐藥性、低毒、低殘留、可提高機(jī)體免疫力、來源廣泛等特點(diǎn)，受到了廣泛的關(guān)注，也開展了一些研究工作[3、4]。為了全面了解中草藥對多種畜禽大腸桿菌的抗菌效果，筆者選用10味中藥單方對從患病豬、雞、兔病料中分離鑒定的大腸桿菌進(jìn)行了體外抗菌試驗，旨在了解這些中藥的抗菌效果，為防治該病的臨床用藥提供參考及研制開發(fā)中草藥方劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥物：金銀花、穿心蓮、蒲公英、連翹、苦參、黃芩、黃柏、板藍(lán)根、大青葉、白頭翁。所有藥材均購自河南省醫(yī)藥公司。

1.1.2 培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱營養(yǎng)瓊脂（均購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠）。

1.1.3 菌株：豬大腸桿菌6株、雞大腸桿菌5株、兔大腸桿菌3株，來自本研究室從患病畜禽病料中分離、鑒定和保存的優(yōu)勢菌株。

1.2方法

1.2.1 中藥制備：每味中藥均按水提法進(jìn)行制備，以金銀花為例，稱取金銀花50g，裝入具塞三角瓶中，加500ml蒸餾水浸泡30min后，加熱至沸后文火煎煮30min，用4層紗布過濾，濾出煎液，藥渣按上述方法再煎煮一次，合并兩次濾液，濾紙過濾，恒溫水浴加熱濃縮至生藥含量為1g/ml，高壓滅菌后，置4℃冰箱保存待用。

1.2.2 培養(yǎng)基制備：普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制，4℃冰箱保存待用。

1.2.3 菌液制備：將菌種接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取典型菌落接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，置37℃溫箱培養(yǎng)24h后，取各菌液0.5ml接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)8-12h后，用L棒刮取菌苔，用滅菌生理鹽水稀釋，后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁鼙葷?。并根?jù)比濁管所含的細(xì)菌濃度稀釋至含菌量106Cfu/ml，備用。

1.2.4 最小抑菌濃度（MIC）測定：用試管二倍稀釋法。以板藍(lán)根抗雞大腸桿菌為例，取滅菌試管11支，編號，每管先加入滅菌肉湯培養(yǎng)基1.0ml，然后于第一管中加入制備好的中藥水提液1.0ml，混勻后取出1.0ml放入第二管，依此類推至第9管，棄掉1ml，第10管不加藥物，作為陽性對照，第11管加中藥水提液化氣1.0ml，混勻后取出1.0ml棄去，不加細(xì)菌，作為陰性對照。取制備好的細(xì)菌稀釋液0.1ml分別加入上述1-10管中混勻，第11管加滅菌生理鹽水0.1ml。第1管至第9 管藥物濃度 （mg/ml） 分別為 500、250、125、62.50、31.25、15.60、7.80、3.90、1.95。置各管于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。陽性對照細(xì)菌生長，呈均勻渾濁狀，陰性對照管無細(xì)菌生長呈澄清、透明狀時，試驗成立，觀察其它各管情況。如試管內(nèi)液體澄清、透明，則無菌生長。以無菌生長的最低稀釋度即為最小抑菌濃度。

1.2.5 最小殺菌濃度（MBC）測定：將上述MIC測定中各管培養(yǎng)物分別畫線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24-48h觀察結(jié)果。菌落數(shù)少于3個視為無菌生長，以無細(xì)菌生長的藥物最低

2 結(jié)果 結(jié)果見表1

濃度，作為該種藥物對該菌的最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.6 結(jié)果的判定：參考劉忠儀等[5]介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC＜7.80mg/ml，為高度敏感，7.80＜MIC＜250mg/ml，為中度敏感，MIC＞250mg/ml，為不敏感。

表110 味中藥對畜禽大腸桿菌的平均MIC和MBC（mg.M1-1）

由表1可知，10味中草藥對14株供試菌均有一定的抗菌效果，但不同種類的中草藥抗菌效果不同，其中抗菌效果最好的是連翹，MIC＜7.80 mg/ml，屬于高度敏感，其次是板藍(lán)根、大青葉、蒲公英、金銀花、穿心蓮，7.80 ＜MIC＜250mg/ml，為中度敏感，黃芩、白頭翁、苦參、黃柏MIC＞250mg/ml，為不敏感。

3 討論

3.1本試驗同時對不同畜禽來源的致病性大腸桿菌進(jìn)行了體外抑菌試驗，結(jié)果表明同一種中草藥對不同的菌株抗菌效果略有差異，有部分中草藥如連翹、板藍(lán)根、大青葉、金銀花等對兔大腸桿菌的抗菌效果好于豬、雞大腸桿菌，這可能和家兔在養(yǎng)殖過程中使用藥物較少有關(guān)系，一般認(rèn)為中藥不易產(chǎn)生耐藥性，但長期、大量使用中草藥，會否產(chǎn)生耐藥性，還需要進(jìn)一步實(shí)驗。目前在中藥的耐藥性方面的研究很少，應(yīng)引起重視，積極開展這方面的研究，為合理用藥、保障生物安全提供依據(jù)。

3.2本試驗在測定中藥的最小抑菌濃度的同時，還測定最小殺菌濃度，更全面的了解了中藥的抗菌活性。另外將不同濃度中藥與受試細(xì)菌作用后，再分別接種普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過觀察細(xì)菌和中藥作用后在培養(yǎng)基上的生長情況來判定最小殺菌濃度，有效的避免了中藥煎煮液的色澤及沉淀對觀察結(jié)果的影響，避免了肉眼觀察可能產(chǎn)生的誤差。使試驗結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

3.3本試難采用了中草藥水提法測定了中藥的MIC。中藥水提法由于需要的設(shè)備簡單、操作方便簡單，可以在較短時間內(nèi)完成大量中藥的篩選，因此該法最為常用。但是，水提法以水作為溶劑，可能影響到一些不溶于水的成分的提取，另一方面，藥物經(jīng)加熱煮沸，并進(jìn)行高壓滅菌，高溫高壓可能會使某些中草藥的藥理活性降低，這些都可能會導(dǎo)致藥物的MIC值偏高[6]，因此尚需進(jìn)行不同提取方法及中藥有效成分的研究，以期能夠完善提取工藝，更好的發(fā)揮中草藥的藥效。

3.4本試驗所得結(jié)果為體外抗菌活性，高度敏感的藥物很少，但中藥治病的機(jī)理是利用中藥的多重復(fù)雜成分共同調(diào)節(jié)機(jī)體平衡，提高機(jī)體免疫力，而不是所有成分直接作用于病原菌達(dá)到治愈疾病的目的。因此，藥物進(jìn)入體內(nèi)后能否達(dá)到有效的抑菌效果和治愈疾病的目的，還有待于進(jìn)一步的動物試驗。

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007，215-223。

[2] 雷連成，江文正，韓文愈，等.致病性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37（1）：12-13.

[3] 吳蕊，許禮發(fā).中藥制劑大腸桿菌體外抑殺作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)動物防制，2008，24（5）：352-355.

[4] 褚秀玲，蘇建青，韋旭斌.中藥抗大腸桿菌病研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（21）：9093-9094.

[5] 劉忠儀，張國威，何云志.解脲支原體中藥藥敏試驗[J].中華皮膚科雜志，1996，29（5）：349.

[6] 侯永清，張挺.不同提取工藝對中草藥抑菌效果的影響[J].飲料工業(yè)，2003，24（2）：9-10