代謝工程改造釀酒酵母高效合成β-葡聚糖

李茜，于文文，呂雪芹，劉延峰，李江華，堵國成，陳敬華*，劉龍*

1(江南大學 未來食品中心，江蘇 無錫，214122)2(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

β-葡聚糖是一種廣泛存在于真菌、藻類和細菌中的細胞壁多糖[1]。β-葡聚糖具有多種生理活性，如抗氧化[2]、抗輻射及抗炎抗腫瘤[3]等。β-葡聚糖作為有效的生物反應調節(jié)劑，可以刺激免疫系統(tǒng)[4]，常用于降低膽固醇，預防冠心病等。

目前，β-葡聚糖的生產方法主要有化學合成法和生物合成法。其中，化學合成法主要采取金催化鄰炔基苯甲酸酯的糖苷化方法構建糖苷鍵，合成β-1,3-葡聚糖[5]。相比化學合成法，生物合成法具有綠色環(huán)保的優(yōu)勢，可以在高效提高產量的同時，解決資源可持續(xù)化問題。與出芽短梗霉等其他微生物相比，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是典型真核模式菌株[6]，且β-葡聚糖在釀酒酵母細胞壁中的高占比(45%～55%)使其成為生物合成β-葡聚糖的最佳底盤細胞[7]。釀酒酵母中的β-葡聚糖主要由β-1,3糖苷鍵連接的吡喃葡萄糖主鏈，以及不同分布位置和長度的β-1,6糖苷鍵連接而成，其生物合成途徑如圖1所示。ZHOU等[8]在釀酒酵母中通過增加β-葡聚糖合成途徑關鍵酶的拷貝數，引入異源葡聚糖合酶以及改善細胞內二磷酸尿苷(uridine diphosphate,UDP)-葡萄糖的含量等策略，將β-葡聚糖的產量提高了53.1%。這證明了關鍵前體UDP-葡萄糖的供應對β-葡聚糖的產量至關重要。在木質纖維素中，葡萄糖作為纖維素的成分之一，是最常見的單糖。而木糖作為半纖維素的主要成分，占木質纖維素生物質的20%～40%[9]。共同利用木質纖維素中的葡萄糖和木糖對于經濟可行地生產生物燃料和化學品至關重要。SU等[10]使用代謝工程，利用木糖-葡萄糖混合發(fā)酵生產類胡蘿卜素，將其產量提高了2.6倍，實現(xiàn)類胡蘿卜素的綠色高效生產。

圖1 釀酒酵母中β-葡聚糖的合成途徑及木糖代謝途徑Fig.1 Biosynthesis pathway of β-glucan and the construction of the metabolism pathway of xylose in S.cerevisiae

此外，β-葡聚糖的生物活性與其分子質量具有高度的相關性。有研究表明，低分子質量的β-葡聚糖具有更良好的生物活性[11-12]。據文獻報道，降低分子質量的方式主要有酶法降解、超聲波降解法和酸降解等[13]。GAO等[14]在畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達了來源于哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的內切β-1,3-葡聚糖酶，并在與農桿菌共培養(yǎng)時，成功將農桿菌中的凝膠多糖水解成為低聚合度的凝膠寡糖。因此，酶解法可以替代傳統(tǒng)復雜的生產程序，簡單高效地生產低聚糖。

該文以釀酒酵母(S.cerevisiae)CEN.PK2-1C為原始菌株，首先對β-葡聚糖合酶及調控亞基的表達進行強化，之后利用基因組多位點整合的方法增加前體UDP-葡萄糖的供應，最后敲除競爭途徑基因alg5，引導更多UDP-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途徑。采用木糖-葡萄糖共利用的策略，在引入木糖代謝途徑后，通過過表達轉運蛋白Hxt7(F79S)和敲除釀酒酵母中葡萄糖阻遏效應的關鍵基因snf1，提高了木糖的消耗速率和β-葡聚糖的產量，最終S12中β-葡聚糖的產量為86.09 mg/g。最后，通過利用釀酒酵母自身的半乳糖誘導啟動子系統(tǒng)[15]，控制內切β-葡聚糖酶基因eng1表達，生成低分子質量的β-葡聚糖。該研究在釀酒酵母中實現(xiàn)了低分子質量β-葡聚糖的高效綠色合成，對β-葡聚糖的經濟可行生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

研究使用的菌株見表1。大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109和DH5α用于重組DNA實驗，SaccharomycescerevisiaeCEN.PK2-1C為本實驗的出發(fā)菌株。菌株、質粒全部保藏在本實驗室。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 5，蛋白胨 10，NaCl 10，121 ℃滅菌 20 min。添加氨芐青霉素用以篩選，終質量濃度為100 μg/mL。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

YPX培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，木糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

YPDX培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，木糖 20，115 ℃滅菌 20 min。

Prime STAR (max) DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；分子操作相關試劑盒，上海生工生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒與菌株構建

來源于樹干畢赤酵母的木糖還原酶基因(xyl1)、木糖醇脫氫酶基因(xyl2)、木酮糖激酶基因(xyl3)為本實驗室前期保存，釀酒酵母的啟動子、目的基因和終止子片段均以S.cerevisiaeCEN PK2-1C基因組為模板擴增，xyl1、xyl2、xyl3基因以質粒pUC57-Amp-Xyl為模板擴增。利用Gibson多片段組裝酶構建質粒，通過PCR及測序驗證質粒是否構建成功。通過融合基因序列的上游和下游構建敲除框，利用CRISPR/Cas9技術整合或者敲除目標基因，分別設計位于基因與同源臂序列上的引物，通過PCR驗證基因是否被成功敲除或整合并測序驗證。研究所用引物見表2。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵

將重組菌接種到添加20 mL YPD/YPX/YPDX液體培養(yǎng)基中30 ℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h制備種子液，檢測OD600。當OD600=0.5時將其轉接至含100 mL YPD液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30 ℃，220 r/min搖瓶培養(yǎng)120 h，檢測中間過程生長OD600、細胞干重及最終產物含量。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.2.3 β-葡聚糖的提取和水解

利用堿提取法對細胞壁中的β-葡聚糖進行提取。首先，將破碎后的細胞溶于60 g/L的NaOH溶液中，90 ℃水浴2 h，然后5 000 r/min離心15 min，沉淀部分用蒸餾水洗2～3次，重懸并在5 000 r/min離心15 min。最后，用體積分數1% HCl調節(jié)pH值至7.0，得到粗制的β-葡聚糖產品，4 ℃保存。

酵母β-葡聚糖樣品在65 ℃的恒溫干燥箱中干燥48 h。稱取10 mg樣品后，加入1 mL濃硫酸，充分混合，室溫下水解30 min。用高濃度的NaOH溶液將pH值調整到7.0，并加入蒸餾水將溶液定容到100 mL。取該溶液3 mL，以5 000 r/min離心15 min，上清液為β-葡聚糖的酸水解液。

1.2.4 檢測方法

發(fā)酵液中的葡萄糖、木糖以及β-葡聚糖酸水解液中的葡萄糖等使用HPLC進行測定，儀器型號為Agilent 1260 Infinity。流動相為5 mmol/L H2SO4溶液，進樣體積為10 μL，色譜柱型號為Aminex?HPX-87H (300 mm×7.8 mm，250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫55 ℃，流速0.6 mL/min，示差折光檢測器，檢測器溫度35 ℃。

β-葡聚糖的分子質量檢測：將提取出的β-葡聚糖樣品溶于二甲基亞砜中，利用高效尺寸排除色譜(high performance size exclusion chromatography, HPSEC)法測定β-葡聚糖的分子質量。儀器型號為Agilent 1260 Infinity，色譜柱型號為Waters WAT011545，流動相0.1 mol/L NaNO3，柱溫45 ℃，流速0.6 mL/min。

2 結果與分析

2.1 β-葡聚糖合成途徑的強化

在β-葡聚糖的生產中，β-葡聚糖合成酶作為關鍵酶發(fā)揮著重要作用。因此，本實驗首先過表達了β-葡聚糖合成酶基因fks1和其調節(jié)亞基基因rho1。將fks1和rho1各增加1個拷貝數，獲得了菌株S1和S2。經過搖瓶發(fā)酵驗證，過表達以上2個基因導致β-葡聚糖的產量提高至38.16 mg/g，出發(fā)菌株的產量為28.3 mg/g，繼續(xù)增加至2個拷貝，發(fā)現(xiàn)S3中β-葡聚糖的產量并未明顯提升。猜測是因為在β-葡聚糖的合成過程中，前體UDP-葡萄糖供應不足導致。

在代謝工程中，強化前體供給是一種常見的高效促進目的產物合成的策略。在釀酒酵母中，β-葡聚糖的合成途徑如圖1所示，葡萄糖依次通過己糖激酶HXK1、磷酸葡萄糖變位酶PGM2和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP1作用合成前體UDP-葡萄糖，最終通過β-葡聚糖合成酶合成β-葡聚糖。因此，在菌株S2中，對β-葡聚糖合成的關鍵前體UDP-葡萄糖合成途徑中的基因進行了強化，分別對ugp1、hxk1和pgm2這3個基因增加1個拷貝數，獲得了重組菌株S4、S5、S6。對以上菌株及對照菌株S2進行了搖瓶發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)S5中β-葡聚糖的產量提高至41.38 mg/g，對照菌株產量為38.16 mg/g。此結果證明，增加基因拷貝數有利于β-葡聚糖產量的提升，因此，繼續(xù)增加至多拷貝，獲得菌株S7、S8。如圖2-a所示，S7、S8的生長情況均有提升，其中S7生長情況最好，OD600為42.16。對比S7、S8中及β-葡聚糖的產量發(fā)現(xiàn)，S7中產量繼續(xù)提升至43.17 mg/g，相比S2提高了13.13%。S8中產量為43.15 mg/g，與S7無明顯差異。因此，選擇S7菌株進行后續(xù)改造。在增加拷貝數后，β-葡聚糖產量雖然得到了提高，但并未達到理想效果，可能是因為UDP-葡萄糖作為釀酒酵母的中間代謝產物，部分流向其他競爭途徑。

a-強化途徑基因；b-敲除途徑基因圖2 重組菌株中β-葡聚糖的產量及OD600分析Fig.2 β-Glucan production and the OD600in engineered strains

2.2 UDP-葡萄糖消耗途徑的阻斷

UDP-葡萄糖作為釀酒酵母中重要的中間代謝產物，它還可以參與糖原合成、蛋白質糖基化等代謝途徑[16]。因此，還可以通過抑制其他競爭支路增加UDP-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途徑的代謝通量。在S7的基礎上，分別單獨敲除了通向糖原合成途徑和蛋白質糖基化途徑的關鍵酶基因glc3和alg5，得到了菌株S9和S10。結果如圖2-b所示，當單獨敲除glc3基因時，β-葡聚糖的產量為44.52 mg/g；當單獨敲除alg5基因時，β-葡聚糖的產量為49.07 mg/g，該結果表明弱化糖原合成途徑和蛋白質糖基化途徑可以有效促進β-葡聚糖的合成。其中S10的產量高于S9，證明敲除alg5基因更有利于β-葡聚糖產量的提高。為驗證兩者同時敲除對β-葡聚糖產量的影響，在S9中對alg5基因進行了敲除，獲得了重組菌株S11。經過發(fā)酵驗證發(fā)現(xiàn)，菌株S11的生長情況雖與S10無明顯差異，S11中β-葡聚糖的產量卻明顯低于菌株S10。上述結果證明，合理調控UDP-葡萄糖的代謝流分布可以提高β-葡聚糖的最終產量。

2.3 木糖-葡萄糖共利用對β-葡聚糖產量的影響

在自然界中，木糖和葡萄糖作為木質纖維素中含量最多的2種單糖，具有來源廣泛、價格低廉、可持續(xù)再生的優(yōu)點。相比利用淀粉水解物來源的葡萄糖為碳源，同時利用木質纖維素中的木糖和葡萄糖更綠色可持續(xù)。由于釀酒酵母無法利用木糖，因此需要在釀酒酵母中重構木糖代謝途徑[17]。木糖代謝基因有眾多來源，本研究選擇了來源于樹干畢赤酵母(Scheffersomycesstipitis)的木糖還原酶基因(xyl1),木糖醇脫氫酶基因(xyl2)，木酮糖激酶基因(xyl3)，通過融合PCR將擴增好的基因片段進行融合。并通過醋酸鋰轉化法轉化至重組菌株S10中，分別在以葡萄糖或木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，并利用HPLC檢測發(fā)酵液中木糖和葡萄糖的含量及β-葡聚糖的產量，結果如圖3所示。

a-菌株生長情況；b-糖消耗情況圖3 引入木糖代謝途徑對細胞生長和碳源消耗的影響Fig.3 Effects of constructing the xylose metabolic pathway on cell growth and sugar consumptions of strains

在以葡萄糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵時，2株菌生長情況無明顯差異(圖3-a)。而在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中，表達xyl1，xyl2，xyl3后的菌株的生長情況比對照菌株更好，證明重組后的Sxyl菌株可以利用木糖。然而，Sxyl在發(fā)酵過程中，木糖消耗僅為4.02 g/L，培養(yǎng)基中的木糖并未得到完全利用，可能是因為釀酒酵母中缺乏戊糖轉運蛋白導致木糖轉運效率低(圖3-b)。為提高木糖轉運能力，在Sxyl基礎上，過表達對木糖具有高親和力的轉運蛋白HXT7(F79S)[18]，獲得菌株SxylM。在以木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中發(fā)酵驗證(圖4-a)，發(fā)現(xiàn)120 h內SxylM消耗的木糖更多。將菌株Sxyl和SxylM置于YPDX培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵，如圖4-b所示，120 h內菌株Sxyl木糖消耗量為5.28 g/L，而SxylM中的木糖消耗量為11.16 g/L，證明轉運蛋白HXT7(F79S)的表達提高了對木糖的轉運能力[18]。同時，SxylM的OD600高于Sxyl，木糖的加入促進了細胞生長。然而如圖4-b、4-c所示，由于釀酒酵母偏好葡萄糖作為碳源，存在葡萄糖阻遏效應，因此當葡萄糖接近耗盡時，細胞才開始利用木糖。為解決上述問題，本研究對葡萄糖阻遏效應中的關鍵基因snf1進行了敲除，獲得菌株S12。如圖4-b～圖4-d所示，在菌株S12中，snf1基因的敲除使葡萄糖利用速率降低，木糖消耗速率升高，實現(xiàn)了葡萄糖-木糖共利用，并將β-葡聚糖的產量提高至86.09 mg/g。

a-木糖唯一碳源中的糖消耗情況；b-混合碳源中的木糖消耗情況；c-混合碳源中的葡萄糖消耗情況；d-不同菌株中的β-葡聚糖產量圖4 轉運蛋白HXT7(F79S)和snf1基因對碳源消耗及β-葡聚糖產量的影響Fig.4 Effect of HXT7(F79S) and snf1 on the sugar consumption and production of β-glucan

β-葡聚糖高產菌株S12與野生型菌株S.cerevisiaeCEN PK2-1C(WT)的相對mRNA表達水平如圖5所示。

圖5 多基因優(yōu)化后各基因表達水平變化Fig.5 The changes on relative mRNA expression of targeted genes by multigene expression optimization

其中，基因alg5、snf1在敲除后，其mRNA表達水平降低。合成途徑基因fks1、hxk1、rho1、pgm2、ugp1在過表達后，mRNA的表達水平提升，表達量分別是野生型菌株的4.25、4.98、5.06、13.21、3.64倍。重組菌株S12的產量同樣高于野生型菌株，與mRNA結果相一致。

2.4 內切β-葡聚糖酶的調控

在獲得了β-葡聚糖的高產菌株后，利用HPSEC檢測重組菌株S12中的β-葡聚糖分子質量，發(fā)現(xiàn)酵母β-葡聚糖的平均分子質量高達1×106～2×106g/mol。β-葡聚糖的高分子質量導致其溶解度降低，在食品、生物醫(yī)藥工業(yè)中的應用受限。釀酒酵母中存在可以水解β-1,3-糖苷鍵的內切β-1,3-葡聚糖酶ENG1[19]，與引入異源水解酶相比，利用誘導型啟動子對內切β-1,3-葡聚糖酶動態(tài)調控的策略更為簡單高效。

由于內切β-葡聚糖酶的分泌與細胞生長周期相關，只在G1期表達。為避免內切β-葡聚糖酶的表達對細胞生長產生不利影響，該實驗選擇半乳糖誘導型啟動子Pgal1，對內切β-葡聚糖酶的表達進行動態(tài)調控[15]。在細胞發(fā)酵后期，加入20 g/L半乳糖誘導內切β-葡聚糖苷酶表達并分泌至胞外，水解細胞壁中的β-葡聚糖，降低分子質量。通過HPSEC檢測，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖的分子質量降低至1.26×105g/mol(圖6)。上述結果表明，內切β-葡聚糖酶可以降低細胞壁中β-葡聚糖的分子質量，進而增加β-葡聚糖的溶解度。

a-內切β-葡聚糖酶的調控表達；b-HPSEC檢測β-葡聚糖的分子質量圖6 重組菌株S13中β-葡聚糖的分子質量Fig.6 Molecular weight of β-glucan in S13

3 結論與討論

β-葡聚糖在食品和醫(yī)藥工業(yè)都具有重要的應用前景，因此，構建高產β-葡聚糖的工程菌株具有重要意義。本研究選擇β-葡聚糖在細胞壁中占比較高的釀酒酵母為底盤細胞，首先通過強化β-葡聚糖合成途徑的基因fks1、rho1，實現(xiàn)了關鍵酶β-葡聚糖合成酶的高效表達；其次通過過表達hxk1、ugp1、pgm2基因，增加了重要前體UDP-葡萄糖的供應，最后敲除了alg5基因，阻斷了UDP-葡萄糖的其他消耗途徑，提高了UDP-葡萄糖至β-葡聚糖的代謝通量，篩選出高產β-葡聚糖的菌株S12。有研究表明，對木質纖維素中的葡萄糖-木糖共利用可以經濟可行地實現(xiàn)目的產物的高效合成。因此，我們利用代謝工程技術，引入了木糖異構途徑，并成功實現(xiàn)了酵母對木糖和葡萄糖的共利用，最終將β-葡聚糖的產量提高至86.09 mg/g。在此基礎上，利用誘導型啟動子，在發(fā)酵后期調控酵母內源β-葡聚糖苷酶基因eng1的表達，對現(xiàn)有菌株中β-葡聚糖的分子質量進行了改造，使其從1×106～2×106g/mol降低到1.26×105g/mol，成功生產出低分子質量的β-葡聚糖。綜上，實驗利用了代謝工程的策略，提高了β-葡聚糖的產量，并降低了它的分子質量，為接下來β-葡聚糖的高效合成奠定了基礎。