從中藥材女貞子中提取藥效成分齊墩果酸最佳工藝研究*

張來(lái)新，趙衛(wèi)星，楊 瓊

（寶雞文理學(xué)院 化學(xué)化工系，陜西 寶雞 721013）

中藥女貞子又名冬青子（為冬青樹之果實(shí)），系木犀科女貞屬植物女貞的成熟果[1]，主產(chǎn)于浙江、江蘇、湖南、河南、四川、陜西等地。我市街巷、路邊、校園、公園等女貞子樹隨處可見，故女貞子的采集容易、價(jià)廉易得。女貞子的有效成分主要有齊墩果酸、女貞子多糖、氨基酸、磷脂及揮發(fā)油等，其中含量最多者為齊墩果酸，用高效液相色譜法測(cè)定果皮果肉含量高達(dá)14%～17%。齊墩果酸（Oleanolic Acid OLA）又名慶四素，系五環(huán)三萜類化合物[2]，其結(jié)構(gòu)式為：

齊墩果酸主要具有護(hù)肝腎[3，4]、降脂、促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抗病毒、抗炎、強(qiáng)心、利尿、抗腫瘤等作用[5-7]，不僅如此，還具有降血糖、降血脂、鎮(zhèn)靜作用[8-10]，是補(bǔ)肝腎和開發(fā)治療肝病和降血糖等藥物有效成分[11]，特別是抗艾滋病毒活性的發(fā)現(xiàn)，也是非常可喜的苗頭[12]。這些都說(shuō)明齊墩果酸具有廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。

由于齊墩果酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難以用化學(xué)方法合成，近年來(lái)大多從植物中提取[13]。目前，國(guó)內(nèi)主要的提取方法有：（1）醇提酸水解法，該法操作簡(jiǎn)便，但收率不高；（2）醇提-酸堿反復(fù)處理法，該法損失量大，收率也不高；（3）發(fā)酵-酸堿反復(fù)處理法，該法耗時(shí)較長(zhǎng)。因此，能否提取分離得到高純度的齊墩果酸直接影響到其更深層次的研究和應(yīng)用。針對(duì)上述問(wèn)題，我們?cè)O(shè)想用一種新的方法，就齊墩果酸的提取分離及性質(zhì)鑒定進(jìn)行研究，以求得探索提取高純度和高產(chǎn)率齊墩果酸較為理想的方法。

1 女貞子中提取齊墩果酸的實(shí)驗(yàn)原理及方法

五環(huán)三萜類化合物齊墩果酸不溶于水，可溶于乙醇、氯仿、丙酮，熔點(diǎn)為310℃。根據(jù)其理化性質(zhì)設(shè)計(jì)的提取方法是：先將女貞子在超聲波中破碎處理，然后高壓蒸煮，再經(jīng)過(guò)攪拌器使果皮、果肉（提取的精原料）與種皮、種仁分離，后用70%乙醇超聲波提取齊墩果酸，提取后用酸和堿交替處理，并加鹽鹽析沉淀→酸處理→活性炭脫色→正己烷脫脂→95%乙醇重結(jié)晶得白色針狀物齊墩果酸。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原料

實(shí)驗(yàn)用女貞子采集于校園女貞樹的干燥成熟果實(shí)女貞子（據(jù)前人經(jīng)驗(yàn)，女貞子生長(zhǎng)為黃褐色采摘較佳[1]，元旦左右采集為宜）。

2.2 儀器及試劑

R系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；調(diào)溫加熱電熱套（河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-B鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司）；752-C型紫外分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；Savant Modulyo凍干機(jī)（美國(guó)Thermo電子公司）；儀表恒溫水浴鍋（上海申光儀器儀表有限公司）；XSZ-G型普通光學(xué)顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；KQ-250B型超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用的各種溶劑和試劑均為分析純；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。

2.3 齊墩果酸的提取方法

2.3.1 女貞子果皮果肉與種皮種仁的分離 有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究表明，齊墩果酸在女貞子中含量占總重量的1.4%，而女貞子果皮、果肉中齊墩果酸含量高達(dá)14%～17%，但種皮種仁中齊墩果酸含量極少[4]。故為了提高齊墩果酸的提取率，在實(shí)驗(yàn)前先將女貞子粉碎，再將齊墩果酸含量高的果皮果肉與種皮種仁分離。提取實(shí)驗(yàn)主要用齊墩果酸含量高的果皮果肉為原料。這樣做一方面可以提高齊墩果酸的提取率，另一方面按操作相同數(shù)量的女貞子求算，可使實(shí)驗(yàn)設(shè)備體積大大縮小，從而提高實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)效率、減少能耗和溶劑用量，并使生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中齊墩果酸損失量大大降低。

2.3.1.1 原料女貞子的蒸煮處理 將干燥干凈的女貞子1.5kg常溫下放置在超聲波容器中超聲（200W）破碎1h，然后用無(wú)菌水浸泡45min，濾去水分后在高壓鍋中施于156906Pa蒸氣壓力下蒸煮1h。高壓蒸煮其目的之一是為滅活酶，另一方面是易于果皮果肉（以下簡(jiǎn)稱皮渣）與種皮種仁的分離。

2.3.1.2 分離皮渣與種皮、種仁 把已蒸煮過(guò)的原料女貞子移入盛有1500mL水的攪拌桶內(nèi)，裝好攪拌器，轉(zhuǎn)速為2500～2800r·min-1，攪拌使果皮被打下，并在水中形成糊狀物。隨后將糊狀物移入水選槽中，啟動(dòng)離心泵使其水液循環(huán)，由于皮渣的密度較小，而種仁、種皮的密度較大，因之在體系循環(huán)水的作用下皮渣浮于上層，而種皮、種仁沉于下層。而后水流將皮渣帶出排出口，再經(jīng)120目尼龍篩過(guò)濾皮渣與水分離，并收集皮渣。

2.3.2 皮渣中齊墩果酸的提取 將皮渣置于3L的提取器中，然后放在超聲波容器（200W）中，加入70%乙醇，600℃回流提取3次，每次50min，合并3次提取液，水浴蒸發(fā)濃縮至粘稠狀物質(zhì)。

2.3.3 齊墩果酸粗產(chǎn)品的分離純化 取上述粘稠狀物質(zhì)，按1∶1加水稀釋并加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1，此時(shí)齊墩果酸等酸性物質(zhì)析出，經(jīng)抽濾得到齊墩果酸粗品。然后將齊墩果酸粗品溶于7倍體積水中，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至11～12煮沸40min，然后將500g食鹽加入其中冷卻至室溫進(jìn)行鹽析，這時(shí)齊墩果酸鈉鹽又重新沉淀析出，而其它有機(jī)酸鈉鹽等則留在母液中，隨后抽濾將析出的齊墩果酸鈉鹽沉淀。將純化過(guò)的齊墩果酸鈉鹽再溶于水，加入鹽酸酸化并調(diào)節(jié)pH值至1～2，冷卻靜置過(guò)夜，抽濾可得到固體齊墩果酸中間品。將該中間品用熱蒸餾水洗脫至無(wú)Cl-，隨后將齊墩果酸沉淀物用6～8倍體積的無(wú)水乙醇熱溶解，其溶液中存在黃褐色物質(zhì)，并有少量膠狀懸浮物存在，為此加入十分之一的活性炭煮沸25min過(guò)濾，溶液中有部分雜質(zhì)被活性炭吸附，使溶液顏色變淡，趁熱抽濾，濾液冷卻靜置過(guò)夜得黃色沉淀，抽濾得微黃色沉淀物。將該沉淀物置索氏提取器濾紙?zhí)淄仓?，加入適量正己烷脫脂，得白色沉淀。該白色沉淀再經(jīng)95%乙醇重結(jié)晶得到白色針狀結(jié)晶提取物齊墩果酸純品。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)果

3.1.1 提取物齊墩果酸物理常數(shù)測(cè)定 將提取的齊墩果酸純品用顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀測(cè)定其熔點(diǎn)為：308～310℃，與手冊(cè)值一致；測(cè)定其比旋光度與手冊(cè)值一致。

3.1.2 齊墩果酸提取率的計(jì)算 精確稱取一定量的干基原料，用無(wú)水乙醇溶解并定容，按照果皮果肉含量15%計(jì)算。最終按下式計(jì)算提取率：

齊墩果酸提取率（mg/g）=重結(jié)晶后提取的齊墩果酸的質(zhì)量（mg）/女貞子果皮果肉質(zhì)量（g）

3.1.3 產(chǎn)品紫外分析表明 女貞子提取物在560nm出現(xiàn)明顯紫外吸收，與齊墩果酸在560nm處的特征吸收峰相符合。

3.2 單因素對(duì)齊墩果酸提取率的影響

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響 在液固比20∶1，超聲波功率300W，提取溫度60℃，超聲波作用時(shí)間50min的條件下，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)，按上述操作提取，結(jié)果見表1。

表1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Tab.1 Influence of ethanol content on extraction rate

由表1可知，齊墩果酸提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高。即由于齊墩果酸為弱極性分子，溶于乙醇而不溶于水，故提取溶液中乙醇含量越高，溶劑極性越弱，齊墩果酸提取率越高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%后，齊墩果酸提取率增加緩慢，但是此時(shí)需消耗較多的乙醇。綜合分析上述情況，實(shí)驗(yàn)中選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%為宜。

3.2.2 超聲波功率對(duì)齊墩果酸提取率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、液固比20∶1、提取溫度60℃、超聲波作用時(shí)間50min的條件下，改變超聲波的功率，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 超聲波功率對(duì)提取率的影響Tab.2 Influence of microwave power on extraction rate

由表2可知，超聲波功率在300W以下，齊墩果酸提取率上升，當(dāng)超聲波功率超過(guò)300W后，齊墩果酸提取率緩慢下降。這是因?yàn)槌暡üβ侍蜁r(shí)，超聲對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用較小。齊墩果酸溶出速率慢，因而提取率較低。功率過(guò)高時(shí)，可能由于局部溫度會(huì)瞬間升高，使齊墩果酸的結(jié)構(gòu)破壞，反而使提取率降低。故選擇超聲波功率200W為最佳。

3.2.3 提取溫度的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲波功率200W，液固比20∶1，超聲作用時(shí)間50min的條件下，改變提取溫度，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 提取溫度對(duì)提取率的影響Tab.3 Influence of temperature on extraction rate

從表3我們不難看出，隨著溫度的升高，提取率逐漸升高，當(dāng)溫度高于60℃后，提取率開始下降。究其原因可能在溫度過(guò)高時(shí)，部分齊墩果酸的結(jié)構(gòu)被破壞，提取率下降。故綜合分析其最佳溫度60℃為宜。

3.2.4 液固比的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲波功率200W、提取溫度60℃、超聲波作用時(shí)間為50min的條件下，改變液固比，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 液固比對(duì)提取率的影響Tab.4 Influence of liguid-solid ratio on extraction rate

由表4可知，隨著提取劑用量的增加，提取率逐漸增大。溶劑用量的增加使齊墩果酸在細(xì)胞壁內(nèi)外擴(kuò)散的濃度差增大，以提高其擴(kuò)散速率而增加提取率。但當(dāng)液固比達(dá)到20∶1后，基本不增加。說(shuō)明液固比達(dá)到20∶1時(shí)，齊墩果酸提取已經(jīng)比較完全，可能因原料中的齊墩果酸含量逐漸減少，濃度差減小或消失，越來(lái)越難溶出。故液固比宜選為20∶1。

3.2.5 超聲波作用時(shí)間的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲波功率200W、液固比20∶1、提取溫度60℃條件下，改變超聲波作用時(shí)間，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 超聲波作用時(shí)間對(duì)提取率的影響Tab.5 Influence of time on extraction rate

由表5可知，隨著時(shí)間的增加，提取率逐漸增大，但超過(guò)50min后，齊墩果酸提取率呈下降趨勢(shì)。究其原因可能是齊墩果酸由于超聲波作用受熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而使其結(jié)構(gòu)被破壞。因此，提取時(shí)間以50min為宜。

綜上所述，從女貞子中提取齊墩果酸的最佳條件為：（1）液固比為 20∶1；（2）超聲波的功率為200W；（3）提取溫度為 60℃；（4）乙醇體積分?jǐn)?shù)為 70%；（5）時(shí)間為超聲波作用50min為宜。

3.3 討論

3.3.1 提取前果皮、果肉與種皮、種仁分離的優(yōu)點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)采用先將女貞子在超聲波中破碎處理，然后高壓蒸煮，再通過(guò)攪拌器使種皮、種仁與果皮、果肉分離，并結(jié)合超聲提取齊墩果酸，結(jié)果使設(shè)備利用率提高，設(shè)備體積縮小、能耗降低、有機(jī)溶劑用量減少、提取過(guò)程產(chǎn)品齊墩果酸的損失量減少，從而節(jié)約了成本，提高了提取效率及經(jīng)濟(jì)效益。彰顯了該工藝的優(yōu)越性，故該法是一個(gè)重要的創(chuàng)新。

3.3.2 本實(shí)驗(yàn)采取超聲波提取的優(yōu)點(diǎn) 超聲波提取法較之于常規(guī)提取法具有提取時(shí)間短、簡(jiǎn)單、收率高等優(yōu)點(diǎn)。提取后用酸和堿交替處理，并加鹽脫水析出齊墩果酸，然后重結(jié)晶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明提取率大大提高，故我們稱此法為“酸沉堿溶鹽析”處理法。

3.3.3 齊墩果酸的鹽析理論依據(jù) 齊墩果酸屬萜類化合物中的五環(huán)三萜酸類物質(zhì)，在女貞子果實(shí)等植物中以游離酸的形式存在，其羧酸鈉鹽的形成使其極性增強(qiáng)，故有類似于肥皂的表面活性劑的作用。鑒于此特性，依據(jù)膠體化學(xué)理論，故在其提取液中加鹽脫水（即鹽析）是提取純化過(guò)程中行之有效的好方法。故我們稱其為“酸沉堿溶鹽析法”。該法實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，效果優(yōu)良，成本低廉，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

3.3.4 女貞子采摘時(shí)間 女貞子生長(zhǎng)為黃褐色采摘較佳[1]。研究表明，女貞子果實(shí)中齊墩果酸的含量隨產(chǎn)地不同和成熟程度的不同而異。一般說(shuō)來(lái)，成熟程度好的女貞子外觀為紫黑色，研究表明該種女貞子中色素成分和其它雜質(zhì)的含量很高，尤其是綠色色素在酸堿介質(zhì)中與齊墩果酸有類似的理化性質(zhì)，故將它們與齊墩果酸分離較為困難。實(shí)踐證明，提取齊墩果酸的女貞子果實(shí)采摘的最佳時(shí)間為黃褐色，因?yàn)榇藭r(shí)女貞子果實(shí)中綠色色素含量很低，而褐色素則含量較高。但褐色色素則易溶于pH值為8～10水相中，故其該雜質(zhì)易與提取物齊墩果酸分離。

3.2.5 女貞子中齊墩果酸含量15%左右見參考文獻(xiàn)[1]，該論文所用的方法優(yōu)于參考文獻(xiàn)所提到的其它方法，其優(yōu)點(diǎn)是找到了最佳提取工藝和最佳提取條件，并提高了提取率。

4 小結(jié)

高純度齊墩果酸提取的最佳工藝為：干燥女貞子果實(shí)→皮仁分離→70%乙醇超聲波提?。?次，每次50min）→酸沉淀（pH值為1～2）→堿處理（pH值為11～12）→鹽析→酸處理（pH值為1～2）→活性炭脫色→正己烷脫脂→冷卻干燥→95%乙醇重結(jié)晶→白色針狀結(jié)晶（產(chǎn)品）。該工藝簡(jiǎn)便易行、提取率高、能耗小、溶劑損失小，有推廣應(yīng)用價(jià)值。

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