多主枝孢霉重組變應(yīng)原Cla h8的制備及其免疫活性鑒定①

楊 柳 付永鋒 李雪萍 馮 萌 程訓(xùn)佳 （復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海 200032）

多主枝孢霉重組變應(yīng)原Cla h8的制備及其免疫活性鑒定①

楊 柳 付永鋒 李雪萍 馮 萌 程訓(xùn)佳 （復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,上海 200032）

目的:通過(guò)基因工程手段,獲得重組多主枝孢霉變應(yīng)原蛋白Cla h8,有利于進(jìn)行變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化,為標(biāo)準(zhǔn)化抗原的臨床特異性診斷與治療奠定基礎(chǔ)。方法:從多主枝孢霉菌體中提取總RNA,采用RT-PCR的方法擴(kuò)增Cla h8編碼基因,將其連入pET-19b載體。轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21 Star（DE3）pLysS,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,進(jìn)行提純復(fù)性,用Western blot和 Dot-blot檢測(cè)其免疫活性。結(jié)果:重組多主枝孢霉變應(yīng)原Clah8蛋白可以與多主枝孢霉過(guò)敏患者的血清中IgE和IgG抗體特異性結(jié)合,與天然蛋白具有相似的免疫活性。結(jié)論:制備并獲得了具有生物學(xué)活性的可溶性重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8蛋白,可用于多主枝孢霉變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化,克服天然提取物的非單一性及標(biāo)準(zhǔn)化難的障礙。

多主枝孢霉;重組變應(yīng)原Cla h8;蛋白表達(dá);變應(yīng)原活性

過(guò)敏性哮喘是危害嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題,其發(fā)病率及死亡率呈持續(xù)上升趨勢(shì)。環(huán)境中存在的各種變應(yīng)原是過(guò)敏性哮喘主要誘發(fā)原因。這些變應(yīng)原包括塵螨、動(dòng)物的皮屑、花粉和霉菌等。在溫濕環(huán)境中,霉菌是引起過(guò)敏性疾病的主要誘因。在全世界,霉菌可引起5%～30%的過(guò)敏患者的IgE反應(yīng)[1]。多主枝孢霉（Cladosporiumherbarum）是引起過(guò)敏性疾病的主要霉菌之一,它不僅是一種主要的室內(nèi)過(guò)敏原,也是夏秋兩季主要的室外過(guò)敏原,可導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的過(guò)敏性哮喘[2]。

多主枝孢霉含有多種變應(yīng)原蛋白,現(xiàn)已被成功純化鑒定的變應(yīng)原有8種。最近,純化出Cla h8是一種NADP依賴性甘露醇脫氫酶（NADP-dependent M tDH）,可被57%左右多主枝孢霉過(guò)敏患者血清中的IgE抗體特異性識(shí)別;臨床皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Cla h8可以引起患者出現(xiàn)皮膚的紅腫,而其它7種變應(yīng)原陽(yáng)性檢出率則不到22%[3]。因而,Cla h8是多主枝孢霉的主要變應(yīng)原,可作為多主枝孢霉過(guò)敏患者的診斷和免疫治療的候選分子。本研究從培養(yǎng)的多主枝孢霉獲得cla h8基因并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),純化制備出具有天然免疫活性的重組Cla h8,實(shí)現(xiàn)多主枝孢霉變應(yīng)原的標(biāo)準(zhǔn)化,為了特異性診斷與免疫治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 多主枝孢霉（C.herbarum）（ATCC 6056）購(gòu)自美國(guó)ATCC菌種庫(kù);原核表達(dá)載體pET-19b購(gòu)自美國(guó)Novagen公司;大腸桿菌JM 109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連TaKaRa公司;E.coliBL21 Star（DE3）pLysS購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料 Rneasy Total RNA kit購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司;GeneAmp RNA PCR Kit購(gòu)自美國(guó)Perkin-Elmer公司;Protein refolding kit購(gòu)自 Novagen公司;Taq酶和100 bp Laddermaker購(gòu)自大連TaKaRa公司;引物合成和測(cè)序由上海Invitrogen公司完成;His-probe（H-3）購(gòu)自美國(guó)Santa公司;鼠抗Cla h8變應(yīng)原單克隆抗體3G10和1F3由本實(shí)驗(yàn)室自制保存;本研究所用患者血清由福建莆田人民醫(yī)院提供并存儲(chǔ)于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 多主枝孢霉的培養(yǎng) 將保存的多主枝孢霉（C.herbarum）菌株接種于100ml YPD培養(yǎng)基（10 g/L yeastextract,20 g/L peptone,20 g/L glucose,pH6.0～6.5）,25～28℃培養(yǎng)6天,離心收集菌體沉淀,PBS緩沖液洗滌菌體三次,-80℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 按照Rneasy Total RNA Kit的使用說(shuō)明,提取多主枝孢霉菌體的總RNA,使用GeneAmp RNA PCRKit進(jìn)行 RT-PCR,獲得cDNA。根據(jù)GeneBank公布的cla h8的mRNA序列（AY191816）設(shè)計(jì)特異性引物,并加入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基。上游引物為 5′-CCCATATGCCTGGCCAGCAAGCAA-3′,下游 引物 為 5′-CGGGATCCTTATCTGGTGGTGTAACCA-3′。 以 cDNA為模板,PCR擴(kuò)增編碼Cla h8成熟肽段的基因片段。經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物以NdeⅠ和BamHⅠ酶切后,插入pET19b載體中。轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109,將菌液涂布于LB瓊脂板（含氨芐青 50μg/ml,氯霉素34μg/m l）,37℃過(guò)夜培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定。

1.2.3 重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8表達(dá) 重組質(zhì)粒 pET19b-Cla h8轉(zhuǎn)入E.coliBL21 Star（DE3）pLysS后,挑取單菌落入800ml LB培養(yǎng)液中（含氨芐青霉素50μg/m l,氯霉素34μg/ml）,37℃振搖培養(yǎng)至OD600約為0.5時(shí),加終濃度為1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG）,37℃誘導(dǎo)3小時(shí)后,4℃10 000 r/min離心10分鐘,收集細(xì)菌沉淀。將沉淀超聲后取其少量,12.5%SDS-PAGE電泳,觀察結(jié)果。

1.2.4 重組多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8純化與復(fù)性參照Protein公司的refolding kit使用說(shuō)明,細(xì)菌沉淀中,加入40 ml IB wash buffer和1 mmol/L苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）,冰上超聲后,加入溶菌酶（終濃度為200μg/m l）混勻,30℃振搖30分鐘后,冰上超聲,10 000 r/min離心10分鐘,棄上清,反復(fù)洗滌直至沉淀的顏色一致。以12.5%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度。將純化復(fù)性后的蛋白,以DC Protein Assay試劑盒測(cè)定蛋白濃度后,4℃冰箱保存。

1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 參照Tachibana等人[5]的方法進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)。多主枝孢霉浸提液和重組Cla h8進(jìn)行還原SDS-PAGE電泳后,電轉(zhuǎn)到醋酸纖維素膜上。以含5%脫脂奶的PBS于濕盒內(nèi)室溫封閉膜1小時(shí);分別加His-probe（H-3）（1∶500稀釋）、鼠抗Cla h8抗體3G10和1F3,多主枝孢霉過(guò)敏的哮喘病人血清（1∶2稀釋）,4℃孵育過(guò)夜;分別加HRP-goat Anti-mouse抗體（1∶500稀釋）,HRP-Mouse Anti-Human IgE抗體（1∶250稀釋）,室溫孵育1小時(shí);以Konica Immunostaining HRP-100顯色,20分鐘后終止反應(yīng),觀察結(jié)果。

1.2.6 Dot blot檢測(cè) 參照Tachibana等人的方法進(jìn)行Dotblot檢測(cè)[6]。分別將多主枝孢霉浸提物2μg和重組Cla h8蛋白2μg加樣于硝酸纖維素膜上,室溫干燥后,以含3%牛血清白蛋白的PBS濕盒內(nèi)室溫封閉1小時(shí);分別加對(duì)多主枝孢霉過(guò)敏的哮喘病人血清（1∶2稀釋和1∶100稀釋）,4℃孵育過(guò)夜;分別加HRP-Mouse Anti-Human IgE抗體（1∶250稀釋）和HRP-Mouse Anti-Human IgG 抗體（1∶250稀釋）,室溫孵育1小時(shí);以Konica ImmunostainingHRP-100顯色,20分鐘后終止反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增Cla h8基因 用RNA提取試劑盒提取多主枝孢霉的總RNA,用引物通過(guò)RTPCR反應(yīng)擴(kuò)增出Cla h8蛋白編碼基因,PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示在800 bp左右處有明顯條帶,大小與理論值（804 bp）相符（圖1）。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與序列分析 表達(dá)載體pET19b-Cla h8經(jīng)NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切,電泳結(jié)果表明目標(biāo)條帶與clah8基因片段的PCR產(chǎn)物大小一致,說(shuō)明成功構(gòu)建了多主枝孢霉變應(yīng)原Cla h8的重組質(zhì)粒pET19b-Cla h8（圖2）。對(duì)cla h8基因片段進(jìn)行測(cè)序鑒定,并將該序列在GeneBank中進(jìn)行注冊(cè)（HQ317138）。與GeneBank中公布的序列（AY191816）進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明cla h8基因片段編碼的氨基酸序列缺少C末端非編碼區(qū)（由63個(gè)核苷酸組成）,并有9個(gè)核苷酸位點(diǎn)與AY191816不同,但未引起氨基酸殘基的改變。

2.3 重組蛋白Clah8的表達(dá) 以重組質(zhì)粒pET19b-Cla h8轉(zhuǎn)入 E.coli BL21 Star（DE3）pLysS,挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng),進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),菌體經(jīng)超聲破碎后,進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示在M r約為33 kD處有明顯條帶。超聲破碎的上清中無(wú)目的蛋白,表達(dá)蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中（圖3A）。

圖1 cla h8基因RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Argarose gel electrophoresis analysis of RT-PCR p roduction of cla h8 gene

圖2 重組表達(dá)載體pET19b-Cla h8的雙酶切鑒定Fig.2 Doub le enzyme cutting result

2.4 重組蛋白Cla h8的純化和復(fù)性 將包涵體反復(fù)洗滌以去除外膜蛋白,直至沉淀顏色一致,SDSPAGE電泳分析,可見(jiàn)較高純度的包涵體（圖3B）。經(jīng)復(fù)性重構(gòu)后,用SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果顯示目的蛋白純度可達(dá)98%以上（圖3C）。DCProtein Assay試劑盒測(cè)定所得純化蛋白的濃度,最終結(jié)果表明每升培養(yǎng)液能夠得到純化重組蛋白22.5mg。

2.5 Western blot分析 經(jīng)過(guò)還原條件SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜后,用本實(shí)驗(yàn)室篩選出的重組Cla h8的單抗細(xì)胞株3G10和1F3分別作用于重組蛋白和天然蛋白,重組蛋白在33 kD處有明顯條帶,天然蛋白在31 kD處有明顯條帶（圖4）。多主枝孢霉過(guò)敏病人血清中的IgE抗體可與重組Cla h8蛋白特異性結(jié)合,其中2號(hào)病人反應(yīng)性最強(qiáng)（圖5）。

圖3 重組蛋白Cla h8的SDS-PAGE分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant Cla h8 protein

圖4 單克隆抗體與多主枝孢霉變應(yīng)原的反應(yīng)性Fig.4 Responses of the monoclonal antibodies to Cladosporium herbarum allergen

圖5 目的蛋白 Cla h8的Western blot鑒定Fig.5 Western b lot analysis of Cla h8 p rotein

圖6 目的蛋白 Cla h8的Dot blot鑒定Fig.6 Dot blotanalysis of Cla h8 p rotein

2.6 Dot blot檢測(cè) 多主枝孢霉浸提物和重組Cla h8蛋白均可與多主枝孢霉過(guò)敏的哮喘病人血清中的IgE和IgG發(fā)生特異性結(jié)合。重組Cla h8蛋白與病人血清中的IgE和IgG抗體的反應(yīng)性要強(qiáng)于多主枝孢霉的浸提液（圖6）。

3 討論

變應(yīng)原可引起不同程度的過(guò)敏性疾病,以哮喘最為常見(jiàn)。全世界現(xiàn)有3億的哮喘患者,其中50%以上的成人和至少80%的兒童患者均由各種環(huán)境中的變應(yīng)原誘發(fā),每年有25萬(wàn)以上的患者死于哮喘。霉菌是引起變態(tài)反應(yīng)性疾病的主要原因之一,其中多主枝孢霉和鏈隔孢霉是主要的致敏真菌。在美國(guó)波特蘭市,30%的哮喘患者與對(duì)多主枝孢霉過(guò)敏有關(guān)[7]。因此,真菌變應(yīng)原對(duì)于變態(tài)反應(yīng)性疾病的診斷與治療具有重要意義,但由于真菌變應(yīng)原蛋白的組分受多種因素影響,以及天然真菌提取液中變應(yīng)原種類繁多,造成制備標(biāo)準(zhǔn)化制劑的難度極大,故限制了它在臨床上的應(yīng)用[8]。

多主枝孢霉變應(yīng)原Clah8是一種NADP依賴性甘露醇脫氫酶（NADP-dependentMtDH）,是多主枝孢霉的主要變應(yīng)原蛋白,可被57%左右多主枝孢霉過(guò)敏患者血清中的IgE抗體特異性識(shí)別,并且皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)可引起患者出現(xiàn)皮膚的紅腫[3]。本研究中,3個(gè)對(duì)多主枝孢霉過(guò)敏的患者血清中IgG和IgE抗體都能與重組Cla h8特異性的結(jié)合,說(shuō)明Cla h8作為多主枝孢霉的主要變應(yīng)原,可以作為對(duì)多主枝孢霉過(guò)敏患者的診斷和特異性免疫治療的候選分子。

利用DNA重組技術(shù)制備霉菌的主要變應(yīng)原,具有成分單一,活性穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),有利于工藝流程的標(biāo)準(zhǔn)化。pET載體系統(tǒng)是一種原核表達(dá)載體,本研究采用的是pET19b,其特點(diǎn)可以在重組蛋白的N末端具有10個(gè)組氨酸標(biāo)簽以利于蛋白純化,因此重組Cla h8比天然蛋白分子大2 kD左右,而組氨酸標(biāo)簽對(duì)重組蛋白生物學(xué)活性影響不大。由于目的蛋白在大腸桿菌BL21 Star（DE3）pLysS中高效表達(dá),蛋白聚積形成不溶性的包涵體蛋白,為此需對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行變性重構(gòu)使其成為與天然蛋白相似的可溶性蛋白。包涵體蛋白的變性重構(gòu)的關(guān)鍵是復(fù)性后的可溶性蛋白和天然蛋白具有相同的生物活性。在還原條件下,重組Cla h8和天然蛋白都能被抗Cla h8鼠單抗和對(duì)多主枝孢霉過(guò)敏病人血清中的IgE和IgG特異性識(shí)別,說(shuō)明重組變應(yīng)原與天然蛋白具有相同線性抗原表位。非還原條件下的Dot bolt也證實(shí)重組變應(yīng)原與天然蛋白具有相同抗原活性。

本研究利用DNA重組技術(shù)建立了Cla h8變應(yīng)原蛋白的制備方法,鑒定了其良好的免疫學(xué)活性。為大量制備標(biāo)準(zhǔn)化真菌變應(yīng)原診斷試劑,推進(jìn)臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化抗原特異性免疫治療奠定了良好基礎(chǔ)。

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[收稿2010-11-27 修回2011-01-11]

（編輯 張曉舟）

Production of recombinantCladosporiumherbarumallergen Cla h8 and investigation on its immunological activities

YANGLiu,FUYong-Feng,LIXue-Ping,FENGMeng,CHENGXun-Jia.DepartmentofMedicalMicrobiologyandparasitology,ShanghaiMedicalCollegeofFudanUniversity,Shanghai200032,China

Objective:To gain large amount of recombinant allergen Cla h8 ofCladosporiumherbarumthrough genetic engineering method,which notonly facilitates the standardization of allergen vaccination,butalso ismore suitable fordiagnosis and treatment.Methods:The total RNA was acquired fromC.herbarumculture,then the clah8 gene fragments amplified by RT-PCRwas cloned into vector pET-19b and then transformed toE.coliBL21 Star（DE3）pLysS.After induction,Cla h8 was expressed as inclusion body inE.coliBL21 Star（DE3）pLysS.The solub le protein,following purification and renaturation,was obtained.The immunological activity was identified by Dot-blot and Western blot.Results:The IgE and IgG of the serum fromC.herbarumallergic patients could specially reactwith the recombinantClah8（rCla h8）,and the immunologicalactivity of rCla h8was comparablewith the native protein.Conclusion:We have successfu lly obtained the recombinantCla h8 equippedwith immunologicalactivity,which leads to significant improvements in allergy diagnosis and treatment.The approach has also resolved the problems of natural allergen extracts associated withmulti-componentand difficult standardization.

Cladosporiumherbarum;Recombinantallergen Cla h8;Protein expression;IgE

R392.8

A

1000-484X（2011）05-0446-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.05.015

①本文受國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2007AA02Z472）和衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目（20082001）資助

楊 柳（1983年-）,女,在讀碩士,主要從事過(guò)敏性疾病診斷與防治研究;

及指導(dǎo)教師:程訓(xùn)佳（1960年-）,女,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事過(guò)敏性疾病診斷、防治和醫(yī)學(xué)原蟲(chóng)的致病機(jī)制與分子生物學(xué)研究,E-mail:xjcheng@shmu.edu.cn。