火雞組織滴蟲體外微量培養(yǎng)方法的改進

何 靜 丁穎 彭俊宇 李芬 湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 長沙 408湖南桃源三尖農(nóng)牧有限責任公司 湖南桃源 45700)

火雞組織滴蟲體外微量培養(yǎng)方法的改進

何 靜1丁穎1彭俊宇2李芬1湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 長沙 4101282湖南桃源三尖農(nóng)牧有限責任公司 湖南桃源 415700)

本研究通過改進火雞組織滴蟲在M199培養(yǎng)液中的體外微量培養(yǎng)方法，為進一步研究其診斷、生活史及致病機制奠定基礎(chǔ)。通過將人工體外培養(yǎng)的組織滴蟲在顯微鏡下反復(fù)檢查、稀釋后用毛細吸管吸取單個蟲體至1.5mL的離心管中，于40℃恒溫箱中進行培養(yǎng)，并用鏡檢和PCR技術(shù)檢查蟲體是否增殖。結(jié)果顯示有2個離心管有蟲體增殖。

組織滴蟲 微量培養(yǎng) PCR火雞組織滴蟲（Histomonas meleagridis）是一種能引起雞形目禽類盲腸和肝臟損傷及機能紊亂的單鞭毛寄生性原蟲[1]。在最近的幾十年間，組織滴蟲病對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重危害。通過人工模擬宿主的體內(nèi)環(huán)境條件,使蟲體在宿主體外完成其寄生階段生長發(fā)育[2]，這種方法可以解決火雞組織滴蟲研究過程中缺乏所需的蟲體材料的問題。到目前為止，已有許多學者成功進行了組織滴蟲的體外培養(yǎng)[3-8]，但這些培養(yǎng)方法都不能獲得純的組織滴蟲，其培養(yǎng)基中除含有組織滴蟲外還含有細菌等許多雜質(zhì)。本文在總結(jié)前人體外微量培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化分離取材、純化及擴增的方法，獲得了純的組織滴蟲，為組織滴蟲病的進一步研究準備了良好的材料，并豐富了火雞組織滴蟲體外培養(yǎng)的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲種：本實驗所用的組織滴蟲蟲體培養(yǎng)的病料來自于用胚胎化的異刺線蟲蟲卵人工感染火雞，使火雞發(fā)生組織滴蟲病，將發(fā)病火雞的盲腸內(nèi)容物進行體外培養(yǎng)所得。

1.1.2 主要試劑：M-199培養(yǎng)基粉、Taq酶（大連寶生物公司產(chǎn)品），蛋白酶K（Merck公司產(chǎn)品），WizardTMDNAClean-up System（Promega公司產(chǎn)品），PCR試劑（Buffer、MgCl2、dNTPs）為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 M-199培養(yǎng)液的配備：用于組織滴蟲體外培養(yǎng)所用的培養(yǎng)液是用購買了GIBCO公司原裝M-199培養(yǎng)基粉末，按照說明書進行配制，4℃保存?zhèn)溆?。使用培養(yǎng)液時，用滅菌吸量管吸取9mL的M-199培養(yǎng)液于細胞培養(yǎng)瓶中，另外再加入11mg滅菌米粉和15%的胎牛血清。

1.2.2 火雞組織滴蟲體外微量培養(yǎng)：在細胞培養(yǎng)瓶中加入9mL M-199培養(yǎng)液，其中含有無機鹽、L－谷氨酰胺、25mMHEPES和L-氨基酸，另外再加入11mg滅菌米粉和15%的胎牛血清。將處于瀕死期患組織滴蟲病的火雞肝臟和盲腸放在40℃恒溫水浴鍋上，用滅菌的剪刀將盲腸剪開，把所有盲腸內(nèi)容物全部放入細胞培養(yǎng)瓶中，放入40℃恒溫箱中進行培養(yǎng)。用滅菌吸管吸取一滴培養(yǎng)液在載玻片上，馬上蓋上蓋玻片，放在10×40倍顯微鏡下進行檢查。如果發(fā)現(xiàn)有類似組織滴蟲的蟲體在其中活動，用吸量管專用鉗子將硼酸硅毛細吸管拉細，使其外徑縮小至2.5mm，制成玻璃微量吸管。將微量吸管靜止固定在顯微鏡上，其玻璃吸管與1個一端帶有空注射器的軟管相連接，并由其抽吸而成形。將含有組織滴蟲的培養(yǎng)液

與新鮮的培養(yǎng)液按1∶100的比例稀釋，以實現(xiàn)培養(yǎng)液視野中可以清晰地看見單個蟲體。將100μL培養(yǎng)液隨機滴數(shù)滴至載玻片上，以挑選單個蟲體。用吸管吸取1滴載玻片上的培養(yǎng)液移至微量離心管中。整個過程用顯微鏡400倍放大進行監(jiān)測，以確保每次只有1個蟲體細胞被轉(zhuǎn)移。分離后將微量離心管中加入1mL新鮮的M-199培養(yǎng)液，移至40℃培養(yǎng)4d。在第2、3、4d用光學顯微鏡監(jiān)測蟲體的生長情況。連續(xù)做平行的10個離心管，每天觀察并記錄每個離心管中組織滴蟲的生長情況，每隔2天轉(zhuǎn)種1次。通過E.Grabensteiner[9]等報道按照基因庫中發(fā)布的序列號為AF293056的序列合成特異性引物進行PCR檢測。將所有的陽性樣品繼續(xù)進行轉(zhuǎn)種培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 組織滴蟲體外培養(yǎng)

將處于瀕死期的疑似患組織滴蟲病的火雞肝臟或盲腸內(nèi)容物放入新鮮的M-199培養(yǎng)液中，在40℃的恒溫箱中進行培養(yǎng)。經(jīng)過48h后，在10×40倍顯微鏡下觀察，可看到視野中有許多呈空泡狀，大小約為5～30μm，形狀不斷變化，類似組織滴蟲的蟲體在視野內(nèi)不斷地進行鐘擺狀運動。

2.2 組織滴蟲微量培養(yǎng)

將含有組織滴蟲的培養(yǎng)液在細胞培養(yǎng)瓶中進行反復(fù)稀釋后，直到在顯微鏡視野中看到1個蟲體為止。然后用拉細的毛細吸管將這1個蟲體吸入已加入1mL配制好的M-199培養(yǎng)液的1.5mL的離心管中，放到40℃恒溫箱中進行培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察并記錄組織滴蟲在離心管中的生長情況，每隔2天轉(zhuǎn)種1次。培養(yǎng)48h后觀察發(fā)現(xiàn)，只在其中的2個離心管中發(fā)現(xiàn)有組織滴蟲增殖，其余8管中未看見有任何蟲體在其中活動，詳請見表1。

2.3 火雞組織滴蟲微量培養(yǎng)液用于PCR檢測

分別從10個進行微量培養(yǎng)的離心管中吸取200μL培養(yǎng)液進行消化后提取DNA，用特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果如圖1。

3 討論

微量培養(yǎng)能夠彌補采用一般的培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)時培養(yǎng)液中除含有所需要的有機體外還含有許多其他雜質(zhì)的不足。早在1978年Farri[10]就通過微量培養(yǎng)法成功地分離培養(yǎng)出溶血性阿米巴原蟲，Oduola[11]等于1988年也采用微量培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出瘧原蟲，緊接著Bushek[12]等獲得了伯金斯蟲單蟲體分離及微量培養(yǎng)技術(shù)的成功。但組織滴蟲的微量培養(yǎng)經(jīng)歷了一個比較長的探索過程，直到2006年M.HESS[13-14]等才首次成功通過用含有組織滴蟲的M-199培養(yǎng)液反復(fù)稀釋后，用拉細的毛細吸管在顯微操作臺上成功地分離出單個的組織滴蟲并且感染試驗動物成功，隨后陸續(xù)有學者進行了組織滴蟲的微量培養(yǎng)[15-16]。

表1 火雞組織滴蟲微量培養(yǎng)結(jié)果

圖1 組織滴蟲微量培養(yǎng)樣品PCR產(chǎn)物電泳圖

本次試驗在顯微鏡下用毛細吸管共分離出10株組織滴蟲，通過顯微鏡檢查和PCR技術(shù)鑒定后發(fā)現(xiàn)，只有2個離心管中的蟲體正常增殖，成功率只有20%。這次組織滴蟲微量培養(yǎng)成功率很低的原因，一方面是由于組織滴蟲本身對外界環(huán)境的抵抗力很弱，并且其體外沒有任何囊膜對其進行保護，還可能由于水分喪失而死亡，因此存活在外界環(huán)境中的蟲體非常有限；另一方面，在進行蟲體分離過程中死亡或者粘在吸管壁上面而沒有被轉(zhuǎn)移至離心管中，也可能是由于蟲體抵抗力太弱，單個的蟲體在培養(yǎng)液中很難生長。因此，筆者建議在進行顯微操作分離蟲體時為蟲體創(chuàng)造一個適宜其生存的環(huán)境。本次通過PCR方法對微量培養(yǎng)材料進行擴增的結(jié)果與顯微鏡觀察結(jié)果完全一致。國外已有M.HESS[14]和E.Grabensteiner[15]等通過設(shè)計不同的引物，直接從培養(yǎng)液中成功擴增出組織滴蟲的基因，并與雞四毛滴蟲和酵母菌相區(qū)別。

[1]Tyzzer,E.E,and F.Fabyan.Further studies on‘blackhead’in turkeys,with special reference to transmission byinoculation[J].Dis,1920,27∶207-239.

[2]薛慶善.體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)[M].北京∶科學出版社,2001∶790-791.

[3]Drbohlav,A.J.The cultivation ofthe protozoan ofblackhead[J].Med.Res.1924,44∶677-678.

[4]廖仁彩，曾元根，周潤清．組織滴蟲病及其研究動態(tài)[J].中國獸醫(yī)雜志，1998，24(2）：50-51．

[5]Tyzzer,E.E.A study of immunizing produced by infected with attenuated culture strain of Histomonas meleagridis[J].Comp.Pathol.Ther.1936,49∶285-303.

[6]Dwyer,D.M.An improved method for cultivating Histomonas meleagridis[J].Parasitol.1970,56∶192-193.

[7]Lesser,E.In vitro cultivation of Histomonas meleagridis free of demonstrable bacteria [J].Parasitol.1961,8∶228-230.

[8]袁帶秀.火雞組織滴蟲病及其蟲體的體外培養(yǎng)的研究[D].湖南農(nóng)業(yè)大學，2004.

[9]Karine Huber,C.Chauve,L.Zenner.Detection of Histomonas meleagridis in turkeys cecal droppings by PCR ampli?cation of the small subunit ribosomal DNA sequence[J].VeterinaryParasitology,2005,131∶311-316.

[10]Farri,T.A.Simple technique for preparing clone cultures of Entamoeba histolytica[J].Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.1978,72,205-206.

[11]Oduola,A.M.J.,Weatherly,N.F.,Bowdre,J.H.and Desjardins,R.E.Plasmodium Falciparum-cloning by single-erythrocyte micromanipulation and heterogeneity in vitro[J].Experimental Parasitology,1988,66,86-95.

[12]Bushek,D.,Holley,R.A.and Reece,K.S.Use of micromanipulation and‘feeder layers’toclone the oyster pathogen Perkinsus marinus[J].Journal ofEukaryotic Microbiology,2000,47,164-166.

[13]M.Hess,E.Grabensteiner and D.Liebhart.Rapid transmission ofthe protozoan parasite Histomonas meleagridis in turkeys and speci?c pathogen free chickens following cloacal infection with a mono-eukaryotic culture[J].Avian Pathology,2006,35(4)∶280-285.

[14]M.Hess,T.Kolbe and E.Grabensteiner.e tal.Clonal cultures of Histomonas meleagridis,Tetratrichomonas gallinarumand a Blastocystis sp.Established through micromanipulation[J].Parasitology,2006,133∶547-554.

[15]E.Grabensteiner,M.Hess.PCR for the identi?cation and differentiation of Histomonas meleagridis,Tetratrichomonas gallinarum and Blastocystis spp[J].Veterinary Parasitology，2006(142)∶223-230.

[16]D.Liebhart,H.Weissenbock and M.Hess.In-situ Hybridization for the Detection and enti?cation of Histomonas meleagridis in Tissues[J].Comp.Path.2006,135,237-242.

[17]Everett E.Lund,Anne M.Chute and Gary C.Wilkins.The wild turkey as a host for Heterakis gallinarumand Histomonas meleagridis[J].Journal ofWildlife Diseases,1975,11∶376-381.

S832

A

1008-3847(2011)04-0002-04

國家自然科學基金（NO.30771616）和湖南農(nóng)業(yè)大學2010年大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（YCX1025）資助。

翁亞彪