nanoUPLC Q-TOF MS/MS在大鼠肝移植蛋白質(zhì)組學(xué)研究中潛在生物標(biāo)記物的應(yīng)用

薛元臻，芮 雯，王 慧

（1.Waters科技有限公司，廣東 廣州 510170；2.廣東藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；3.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100037）

nanoUPLC Q-TOF MS/MS在大鼠肝移植蛋白質(zhì)組學(xué)研究中潛在生物標(biāo)記物的應(yīng)用

薛元臻1，芮 雯2，王 慧3

（1.Waters科技有限公司，廣東 廣州 510170；2.廣東藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；3.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100037）

建立應(yīng)用納升級(jí)超高效液相色譜－質(zhì)譜（nanoUPLC Q-TOF MS/MS）聯(lián)用技術(shù)研究大鼠同位肝移植術(shù)后不同時(shí)間差異表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法。建立10組大鼠肝移植動(dòng)物模型后，隨機(jī)分成術(shù)后3天組（n＝5）和術(shù)后7天組（n＝5）。分別于術(shù)后3天和7天處死5只受體，取肝組織，提取總蛋白，Trypsin酶解后，使用Waters公司獨(dú)家專利MSeTM無標(biāo)記定量技術(shù)，利用nanoUPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)酶解后的肽段進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)，采用生物信息學(xué)工具對(duì)所鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分類。7天組與3天組相比，兩樣品中同時(shí)存在的大部分蛋白上調(diào)，其中10個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)水平明顯上調(diào)，比值變化在8.5倍以上。結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索得到鑒定，這些明顯上調(diào)的蛋白的分子功能主要與細(xì)胞骨架、離子結(jié)合、氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝等相關(guān)。

生物標(biāo)記物；納升級(jí)超高效液相色譜；液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用；肝移植；蛋白質(zhì)組學(xué)

肝移植動(dòng)物模型是探討移植后各種免疫反應(yīng)發(fā)生機(jī)制不可缺少的手段。目前國(guó)際上涉及大鼠肝移植免疫反應(yīng)的研究均采用近交系，有較多的排斥模型可供選擇，如DA→AUG、LEW→AUG、 DA→LEW、 LEW→Brown Norway等［1－3］。但國(guó)內(nèi)由于嚴(yán)重缺乏近交系大鼠，所以大多數(shù)仍用Wistar→SD或SD→Wistar建立急性排斥模型［4－5］。本課題組發(fā)現(xiàn)封閉群SD 和Wistar大鼠原位肝移植組合，出現(xiàn)了自然免疫耐受，表現(xiàn)為存活時(shí)間較文獻(xiàn)報(bào)道明顯延長(zhǎng)［4－5］，難以滿足急性排斥反應(yīng)或免疫耐受研究的需要。

基于質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代興起的新型學(xué)科，是從整體水平對(duì)蛋白質(zhì)的綜合分析，在了解疾病發(fā)生的機(jī)制、尋找疾病相關(guān)的“生物標(biāo)記物”（biomarkers）等諸多領(lǐng)域中發(fā)揮重要的作用［6］。本實(shí)驗(yàn)使用Waters公司獨(dú)家專利MSeTM無標(biāo)記定量技術(shù)（Expression＠ Label Free Quantities），通過利用nanoUPLC-MS/MS技術(shù)觀察肝移植后不同時(shí)間蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，進(jìn)一步驗(yàn)證和探討大鼠肝移植模型 Wistar→SD出現(xiàn)自然免疫耐受的原因，為建立動(dòng)物模型提供量化的指標(biāo)，以及為發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)記物提供方向和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Waters nanoAcquity納升流速超高效液相色譜儀，Waters Synapt Q-TOF高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；過濾器：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；超速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品。

碳酸氫銨、異硫氰酸胍（Guanidine）：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二硫蘇糖醇（DTT）：美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；碘乙酸：美國(guó)Pierce Endogen公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin）：美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；RIPA裂解液、BCA protein assay kit（蛋白定量試劑盒）：美國(guó)Biomed公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與手術(shù)方案

本實(shí)驗(yàn)所用大鼠購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，品系為雄性封閉群Sprague-Dawley（SD）和 Wistar大鼠，8～10周齡，體重200～250g，受體鼠體重略重于供體大鼠。飼養(yǎng)條件SPF級(jí)，受體鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水，術(shù)后自由進(jìn)食水。大鼠原位肝移植采用改良Kamada［7］雙袖套法。將10只Wistar大鼠作為供體，10只SD大鼠作為受體，術(shù)后隨機(jī)分成兩組。第一組：術(shù)后3天組；第二組：術(shù)后7天組。手術(shù)采用乙醚開放式麻醉，在無菌條件下進(jìn)行。

1.3 樣品處理和蛋白的提取

分別于大鼠肝移植術(shù)后3天和7天處死大鼠，取肝組織后，迅速放入預(yù)冷PBS中漂洗，去除組織中的血液，用濾紙吸去多余的液體，加入RIPA 裂 解 液 （50mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl；1%Triton X-100，1%sodium deoxycholate，0.1%SDS，sodium orthovanadate；sodium fluoride，EDTA等多種磷酸酶抑制劑），用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。充分裂解后取10～14kg離心3～5min，取部分上清用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，其余上清分裝，于－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 大鼠肝移植后差異表達(dá)蛋白圖譜的建立

1.4.1 nanoUPLC條件 色譜柱：nanoAcquity 10cm BEH 柱100μm，10k；流動(dòng)相 A：0.01%FA＋ Water；流 動(dòng) 相 B：0.01%FA＋ACN；流速0.3μL/min；進(jìn)樣體積1μL；柱溫35℃；梯 度 洗 脫 條 件 （B%/min）：2/0，50/60，80/61，2/62。

1.4.2 質(zhì)譜條件 Waters Synapt HDMS QTOF，正離子模式運(yùn)行，錐孔電壓25eV，碰撞電壓20～40eV，毛細(xì)管電壓3kV，霧化氣流速0.2L/h，源溫度100℃。

1.4.3 樣品前處理樣品按照Waters RapiGestTMSF Surfactant提供的胰蛋白酶Trypsin酶解實(shí)驗(yàn)步驟，并根據(jù)實(shí)際情況做了一些修改。取約1mg總蛋白樣品放入離心管中，加入1mL 6mmol/L Guanidine溶液（配制在100mmol/L NH4HCO3中，pH 8.0），得到 1 g/L蛋白溶液。加入20mL 1mmol/L DTT到上述離心管中，震蕩混合5s，并在60℃條件下恒溫反應(yīng)30min（以還原蛋白中的雙硫鍵）。加入25μL新鮮配制在1mmol/L NaOH中的Iodoacetic acid，避光、室溫條件下放置30min。將以上樣品平均注入2個(gè)（每個(gè)約注入500μL）具有分離10ku以下蛋白的Centricon filter，以12 000r/min離心50min。在以上離心管中分別加入200μL 0.1mmol/L NH4HCO3，并離心30min。多次重復(fù)此操作，以使蛋白樣品中的Guanidine含量降至0.5mmol/L左右。將以上2個(gè)離心管濾層上的蛋白樣品，分別、多次加入總量約500μL 0.1mmol/L NH4HCO3溶液以完全溶解，并將這些含有蛋白樣品的溶液轉(zhuǎn)移至裝有20μL的Trypsin試管中，再加入500μL 0.1mmol/L NH4HCO3溶液，使試管中液體的總量為1 000μL，Trypsin約占總量的1/50。將上述試管恒溫在37℃水浴中反應(yīng)16h，分別吸取500μL上述樣品到2個(gè)Centricon filter中，以13 400r/min離心50min，這樣可以除去多余的Trypsin，終止酶切反應(yīng)。將上述2個(gè)離心管下部的濾出液收集到1個(gè)離心管中，在35℃下真空干燥濃縮60min。此過程有助于NH4HCO3的分解并揮發(fā)，降低樣品中鹽的濃度。繼續(xù)干燥濃縮至樣品量到100μL左右，加0.1%甲酸溶液定量至所需要的樣品濃度，并注意觀察樣品溶液是否澄清。若樣品溶液有渾濁狀，需在12 000～14 000r/min條件下離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.4.4 差異表達(dá)蛋白的鑒定 本實(shí)驗(yàn)使用MSeTM無標(biāo)記定量技術(shù)，通過利用 Waters nano－Acquity納升流速超高效液相（nanoUPLC）WatersQ-TOF高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)，對(duì)大鼠的肝組織蛋白提取液進(jìn)行定性定量比對(duì)。為確保數(shù)據(jù)的精確性和重現(xiàn)性，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品（Enolase）、空白、實(shí)際樣品進(jìn)樣3次或以上，連續(xù)進(jìn)樣以及隔天進(jìn)樣的嚴(yán)格測(cè)試。并在大鼠（M＿musculus）蛋白數(shù)據(jù)庫中加入標(biāo)準(zhǔn)品（P00924）的蛋白序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索。在ProteinLynx Global ServerTM2.3搜索的條件設(shè)置上，所有進(jìn)行定量蛋白必須同一樣品重復(fù)出現(xiàn)2次或以上（3次），最大限度確保數(shù)據(jù)的可靠性和重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

蛋白質(zhì)組技術(shù)是后基因組時(shí)代基因功能研究的重要內(nèi)容，其中2DE/MS是目前蛋白質(zhì)研究中使用最為廣泛的方法。雖然2DE/MS技術(shù)在一次分析中可以分離、識(shí)別上千種蛋白質(zhì)，但整個(gè)過程包括2DE、蛋白質(zhì)點(diǎn)切割、蛋白酶解、多肽混合物提取及質(zhì)譜分析等多個(gè)步驟的手工操作，存在耗時(shí)長(zhǎng)、重復(fù)性較差、自動(dòng)化程度低等缺點(diǎn)，同時(shí)蛋白的分離還受到豐度、疏水性、pH值和分子質(zhì)量范圍等因素的限制。色質(zhì)聯(lián)用是近幾年發(fā)展迅速的方法。蛋白質(zhì)混合物直接通過液相色譜分離，然后進(jìn)入質(zhì)譜獲得分子質(zhì)量信息并對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定。超高效液相色譜（UPLC）是近年來液相色譜技術(shù)的新發(fā)展，通過增加液相系統(tǒng)耐高壓性能，降低色譜柱固定相粒徑、色譜柱內(nèi)徑及長(zhǎng)度，從而減小了理論塔板高度、增加了理論塔板數(shù)，實(shí)現(xiàn)了縮短分析時(shí)間、增加色譜峰容量，提高分離度和靈敏度的作用，可以滿足對(duì)色譜分析的高效、快速、高通量等性能的要求。同時(shí)，超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用也使得質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度顯著提高。

蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)刹糠郑合鄬?duì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)（也稱比較蛋白質(zhì)組學(xué)）是指對(duì)不同生理病理狀態(tài)下，細(xì)胞、組織或體液蛋白質(zhì)表達(dá)量進(jìn)行的相對(duì)比較分析，如基于二維凝膠電泳（2-DE）技術(shù)直接對(duì)處于不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達(dá)變化的比較分析［12］、熒光膠內(nèi)差示電泳技術(shù)（differential in-gel electrophoresis，DIGE）［13］、基于同位素親和標(biāo)簽（isotope coded affinity tags，ICAT）與質(zhì)譜分析結(jié)合的相對(duì)定量技術(shù)［14－15］、等量標(biāo)簽相對(duì)定量方法（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）［16］和金屬元素絡(luò)合物標(biāo)簽結(jié)合質(zhì)譜相對(duì)定量方法等［17］；無標(biāo)記（1abel-free）蛋白質(zhì)組絕對(duì)定量原理對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)不同濃度下蛋白質(zhì)檢測(cè)到的肽段數(shù)目、鑒定的概率得分、被鑒定肽段的離子數(shù)、色譜保留時(shí)間等研究，蛋白質(zhì)的濃度經(jīng)一些相應(yīng)的數(shù)學(xué)變換后（如指數(shù)變換）與質(zhì)譜數(shù)據(jù)的某些參數(shù)呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)，可以根據(jù)肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，間接的估計(jì)蛋白混合物中單一蛋白的絕對(duì)量［18］。本實(shí)驗(yàn)利用ExpressionE無標(biāo)識(shí)量化系統(tǒng)能夠在試驗(yàn)的相對(duì)或絕對(duì)蛋白質(zhì)濃度下，為所有需要的蛋白質(zhì)提供獨(dú)特的識(shí)別能力。高帶寬的UPLC MSE數(shù)據(jù)采集功能與利用多肽段、無標(biāo)識(shí)的蛋白質(zhì)量化識(shí)別功能集于一體，采用先進(jìn)的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，綜合地繪制出復(fù)雜生物系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)圖譜。

本實(shí)驗(yàn)使用Waters公司獨(dú)家專利LC/MSE無標(biāo)記定量技術(shù)（ExpressionELabel Free Quantities），通過利用Waters nanoAcquity納升流速超高效液相Waters Q-TOF高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，將大鼠肝移植術(shù)后3天和7天的肝組織經(jīng)過樣品前處理后，可直接進(jìn)行上樣。大鼠肝移植術(shù)后7天的肝組織色譜圖示于圖1。

圖1 nanoUPLC-MS/MS分析大鼠肝移植術(shù)后7天肝組織的色譜圖Fig.1 nanoUPLC-MS/MS analysis of the sample chromatogram after 7days of liver transplantation in rats

近幾年，蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)開始被應(yīng)用到器官移植的同種異體排異反應(yīng)以及排異反應(yīng)相關(guān)生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域［8］。Vascotto等［9］應(yīng)用2-DE 和 MALDI-TOF-MS 技 術(shù) 發(fā)現(xiàn)肝移植供體肝臟中有36個(gè)蛋白在缺血再灌注損傷時(shí)發(fā)生明顯變化，其中多數(shù)蛋白在脂質(zhì)和能量代謝、氧化還原信號(hào)以及氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮作用。張春潮等［10］利用熒光差異顯示雙向凝膠電泳，并整合內(nèi)標(biāo)法與正、反相熒光標(biāo)記，對(duì)急性排異組和對(duì)照組大鼠肝移植后的肝組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有助于進(jìn)一步了解器官移植排異反應(yīng)的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)是在封閉群SD和Wistar之間建立大鼠原位肝移植模型，但術(shù)后存活時(shí)間較文獻(xiàn)報(bào)道明顯延長(zhǎng)，出現(xiàn)了自然耐受現(xiàn)象。為了驗(yàn)證和進(jìn)一步探索這種現(xiàn)象，使用MSeTM無標(biāo)記定量技術(shù)，通過利用 Waters nanoAcquity納升流速超高效液相 WatersQ-TOF高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)肝移植后不同時(shí)間的肝組織進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在大鼠肝移植后3天和7天的肝組織中共鑒定出表達(dá)的蛋白111個(gè)，其中表達(dá)量差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的（P＜0.05）蛋白48個(gè)，示于圖2。蛋白在大鼠肝移植后7天與3天的表達(dá)量比值大于1.5時(shí)，表示蛋白表達(dá)量上調(diào)，小于0.67則表示下調(diào)。兩樣品中同時(shí)存在的大部分蛋白上調(diào)，最多達(dá)到23.81倍。這些表達(dá)量差異的蛋白的分子功能主要與細(xì)胞骨架、離子結(jié)合、氧化應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝相關(guān)，列于表1。Beta-ETF是一種含有黃素核苷酸輔基的電子載體蛋白，它存在于生物體細(xì)胞線粒體膜上，起傳遞電子作用，是作為還原型脂肪乙酰輔酶A脫氫酶和電子傳遞體系之間的一個(gè)連結(jié)環(huán)節(jié)。F-ATPase delta subunit包括F1：親水部分 （動(dòng)物：α3β3γδε亞基復(fù)合體、OSCP、IF1亞基），線粒體內(nèi)膜的基質(zhì)側(cè)顆粒狀突起，催化ATP合成。F0：疏水部分（ab2c9～12亞基，動(dòng)物還有其他輔助亞基），鑲嵌在線粒體內(nèi)膜中，形成跨內(nèi)膜質(zhì)子通道。ATP合酶組成可旋轉(zhuǎn)的發(fā)動(dòng)機(jī)樣結(jié)構(gòu)：F0的2個(gè)b亞基的一端錨定F1的α亞基，另一端通過δ和α3β3穩(wěn)固結(jié)合，使a、b2和α3β3、δ亞基組成穩(wěn)定的定子部分。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的Ca2＋結(jié)合蛋白，在細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。圖3、圖4為選取的清晰的MS/MS譜圖，通過ProteinLynx Global Server軟件對(duì)肽段碎片做詳細(xì)裂解分析，顯示出此方法對(duì)肽段測(cè)序有較高的可靠性。大鼠肝移植術(shù)后7天與3天相比，這些蛋白質(zhì)表達(dá)量的增加說明大鼠的肝臟正在再生和恢復(fù)過程之中，與術(shù)后存活時(shí)間長(zhǎng)，出現(xiàn)自然耐受現(xiàn)象相一致，但就其各個(gè)蛋白在自然耐受中的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

圖2 Protein Lynx Browser軟件分析差異蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein Lynx Browser software to analyze differences in protein levels

表1 大鼠肝移植后3天和7天肝組織中表達(dá)明顯上調(diào)的蛋白Table 1 Proteins markedly up-regulated during liver regeneration 3dand 7dafter liver transplantation in rats

圖3 大鼠肝移植術(shù)后3天protein（disulfide isomerase OS Mus musculus GN P4hb）中肽段MS/MS譜圖Fig.3 MS/MS spectrum of peptide from protein（disulfide isomerase OS Mus musculus GN P4hb）identified by ProteinLynx Global ServerTMsoftware after 3days of liver transplantation in rats

圖4 大鼠肝移植術(shù)后7天Beta-Globin（OS Mus musculus GN Hbb b1）中肽段MS/MS譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of peptide from Beta-Globin（OS Mus musculus GN Hbb b1）identified by ProteinLynx Global ServerTMsoftware after 7days of liver transplantation in rats

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了應(yīng)用nanoUPLCMS/MS技術(shù)研究大鼠同位肝移植術(shù)后不同時(shí)間差異表達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，并對(duì)其進(jìn)行了初步的分析，驗(yàn)證了 Wistar→SD大鼠肝移植術(shù)后自然免疫耐受現(xiàn)象的存在，為大鼠肝移植模型的建立奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。在目前技術(shù)平臺(tái)上，蛋白及多肽的鑒定數(shù)據(jù)已基本滿足該模型的建立，如果需要做進(jìn)一步的數(shù)據(jù)深入分析（如未知蛋白和多肽的研究方向），也可以在蛋白鑒定后對(duì)數(shù)據(jù)再進(jìn)行從頭測(cè)序（De Novo Sequencing）。

［1］ADACHI K，F(xiàn)UJINOM，KITAZAWA Y，et al.Exogenous expression of Fas-ligand or CrmA pro longs the survival in rat liver transplantation［J］.Transplant Proc，2006，38（8）：210-213.

［2］VISSERS J P C，LANGRIDGE J I，AERTS J M F G.Analysis and quantification of diagnostic serum markers and protein signatures for gaucher disease［J］.Molecular ＆Cellular Proteomics，2007，6：755-766.

［3］LEVIN Y，SCHWARZ E，WANG L，et al.Label-free LC-MS/MS quantitative proteomics for large-scale biomarker discovery in complex samples［J］.J Sep Sci，2007，30（14）：2 198-2 203.

［4］YAMAMOTO S，OKUDA T，YAMASAKI K，et al.FK778controls acute rejection after rat liver allotransplantation showing positive interaction with FK506［J］.Transplant Proc，2005，37（1）：126-129.

［5］CORDOBA S，WANG C，WILLIAMS R，et al.Gene array analysis of a Rat model of liver transplant tolerance identifies increased complement C3 and the STAT-1/IRF-1pathway during tolerance induction［J］.Liver Transp l，2006，12（4）：636-643.

［6］孟珂?zhèn)?，宋占文，周先亭，?大鼠原位肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)中Fractalkine的表達(dá)及意義［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2007，21（5）：528-531.

［7］陸炯炯，杜雋銘，周學(xué)平，等.大鼠原位肝移植術(shù)后排斥反應(yīng)病理動(dòng)態(tài)變化［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2007，27（4）：475-477.

［8］VIVANCO F，MAS S，DARDE V M，et al.Vascular proteomics［J］.Proteomics Clin Appl，2007，1（1）：1 102-1 122.

［9］KAMADA N，CALNE R Y.Orthotopic liver transplantation in the rat：Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage［J］.Transplantation，1979，28：47-49.

［10］WISHART D S.Metabolomics：The principles and potential applications to transplantation［J］.Am J Transplant，2005，5（12）：2 814-2 820.

［11］VASCOTTO C，CESARATTO L，DAMBROSIO C，et al.Proteomic analysis ofliver tissues subjected to early ischemia/reperfusion injury duringhuman orthotopic liver transplantation［J］.Proteomics，2006，6：3 455-3 465.

［12］LILLEY K S，RAZZAQ A，DUPREE P.Twodimensional gel electrophoresis：Recent advances in sample preparation，detection and quantitation［J］.Current Opinion in Chemical Biology，2002，6（1）：46-50.

［13］ALBAN A，DAVID S O，BJORKESTEN L，et al.A novel experimental design for comparative twodimensional gel analysis：Two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating apooled internal standard［J］.Cell ＆ Molecular Biology，2003，3（1）：36-44.

［14］GYGI S P，RIST B，GERBER S A，et al.Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags［J］.Nature Biotechnology，1999，17（10）：994-999.

［15］孟慶芳，張養(yǎng)軍，蔡 耘，等.親和標(biāo)記－基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜用于蛋白質(zhì)相對(duì)定量方法的研究［J］.分析化學(xué)，2006，34（7）：899-904.

［16］CHONG P K，GAN C S，PHAM T K.Isobaric tags for relative and absolute quantitation（iTRAQ）reproducibility：Implication of multiple injections［J］.Journal of Proteome，2006，5（5）：1 232-1 240.

［17］LIU H，ZHANG Y，WANG J，et al.Method for quantitative proteomics research by using metal element chelated tags coupled with mass spectrometry［J］.Analytical，2006，78（18）：6 614-6 621.

［18］曹 冬，張養(yǎng)軍，錢小紅.基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)絕對(duì)定量方法研究進(jìn)展［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2008，29（3）：185-189.

nanoUPLC Q-TOF MS/MS Analysis of Potential Biomarker in Liver Transplant Between Sprague Dawley（SD）and Wistar

XUE Yuan-zhen1，RUI Wen2，WANG Hui3
（1.Waters Technologies Limited，Guangzhou510170，China；2.Institute of Materia Medica，Guangdong College of Pharmacy，Guangzhou510006，China；3.School of life Science，Capital Normal University，Beijing100037，China）

Novel approaches for the qualitative and quantitative proteomics analysis by nanoscale LC/MS was applied to the study of protein expression respond in organ transplant.In this experiment nanoUPLC Q-TOF-based LC-MS/MS platforms was evaluated for shotgun proteomics by compare the protein level after the liver transplant between Sprague Dawley（SD）and Wistar.A brand new technology label-free LC/MS called MSeTMfrom a nanoUPLC and Q-TOF（Waters）was applied attempt to establish a scientific model to for the liver transplant between Sprague Dawley（SD）and Wistar.The result is most of the protein found in the model are up-regulated between the 3days sample and the 7days sample after transplant.The novel LC/MS technology provides a fast and reliable research platform in the modeling of transplant proteomic research，provides the opportunities for discovery of new potential biomarkers.

biomarkers；nanoUPLC；LC-MS/MS；liver transplant；proteomics

薛元臻（1977～），男（漢族），廣東人，博士，生物技術(shù)專業(yè)。E-mail：johnxyz88＠hotmail.com

O 657.63

A

1004-2997（2011）05-0314-07

2010-11-30；

2011-06-01