復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑對(duì)大鼠睪丸的毒性

董正謀，劉魯川，安建平，劉 寧，劉 銳，周 霞，葉麗君

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所口腔科，重慶 400042)

復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑對(duì)大鼠睪丸的毒性

董正謀，劉魯川，安建平，劉 寧，劉 銳，周 霞，葉麗君

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所口腔科，重慶 400042)

目的:觀察復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑對(duì)大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)和氧化損傷指標(biāo)的影響。方法:40只SD雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組和低、中、高劑量組，每組10只;低、中、高劑量組每日按體質(zhì)量(1、4、8g/kg)灌服復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑，陰性對(duì)照組每日按體質(zhì)量灌服雙蒸水，連續(xù)42d，與雌鼠交配成功后處死雄鼠，計(jì)算睪丸、附睪系數(shù)，進(jìn)行精子計(jì)數(shù)和活動(dòng)度檢查，睪丸行超微結(jié)構(gòu)觀察，并檢測(cè)睪丸中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果:高劑量組睪丸、附睪系數(shù)減小，精子數(shù)量減少、活動(dòng)度降低，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，高劑量組睪丸超微結(jié)構(gòu)有損傷;中劑量組睪丸MDA含量上升、CuZn－SOD活力降低，高劑量組睪丸 MDA含量上升、Mn－SOD活力和CuZn－SOD活力下降，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論:高劑量復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑對(duì)大鼠睪丸有一定的毒性，MDA含量升高、SOD活力下降可能是其作用機(jī)制之一。

牙周緩釋制劑;睪丸;超微結(jié)構(gòu);氧化損傷

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2011，21(1):19］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):19］

牙周病是口腔疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，嚴(yán)重影響人類健康。抗生素是牙周病治療的重要手段，將其局部應(yīng)用于牙周已成為一種全新、有效的給藥途徑，復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑是其中的代表之一。本研究在一定時(shí)期內(nèi)對(duì)雄性大鼠灌服復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑，觀察該制劑對(duì)大鼠睪丸的毒性，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑(0.01g/枚，自制);MDA 測(cè)試盒、SOD 測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所);冰醋酸(重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠)。TECNAI－10透射電子顯微鏡(飛利浦公司，荷蘭);Eb－280M電子天平(libror公司，日本);高速低溫離心機(jī)(貝克曼公司，美國(guó));全波長(zhǎng)酶標(biāo)測(cè)定儀(賽默飛公司，美國(guó));7200可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Unic公司，美國(guó));420型三用恒溫水浴箱(江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 動(dòng)物分組和給藥

取體質(zhì)量(200±20)g的11～13周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠40只［第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXKC(渝)2007－0005］。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察一般情況，無(wú)異常后按隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組和低、中、高劑量組，共4組，每組10只分籠喂養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度(22±3)℃，相對(duì)濕度50%～60%，人工照明，12 h光照，12 h黑暗，食用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。

低、中、高劑量組每日按體質(zhì)量1、4、8g/kg(折合原料藥 0.1、0.4、0.8g/kg，相當(dāng)于臨床成人全口牙用量的156.25、625、1 250倍)的劑量經(jīng)胃灌服復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑，陰性對(duì)照組經(jīng)胃灌服相應(yīng)體積雙蒸水，每天1次，連續(xù)42d，然后與同組平行喂養(yǎng)的SD雌性大鼠(其來(lái)源、飼養(yǎng)條件同SD雄性大鼠)交配，交配成功后處死雄鼠，觀察大鼠睪丸的毒性。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 睪丸、附睪系數(shù)和精子計(jì)數(shù)的觀察

大鼠處死后解剖，仔細(xì)分離睪丸、附睪，稱重后按以下公式計(jì)算其系數(shù):睪丸(附睪)系數(shù)=雙側(cè)睪丸(或附睪)質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100。精子計(jì)數(shù)觀察:取附睪置2 mL 37℃生理鹽水中剪碎，混勻，制成精子懸液，吸精子懸液移入離心管中，置60～80℃水浴使其死亡，取懸液1滴，滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，計(jì)數(shù)精子數(shù)。

1.3.2 精子活動(dòng)度觀察

按精子計(jì)數(shù)相同的方法迅速制備精子懸液，將懸液放在37℃水中孵育15 min，室溫(26℃)下10 min內(nèi)完成200個(gè)精子的活動(dòng)度分級(jí)，精子活動(dòng)度分為:A級(jí)(快速前向運(yùn)動(dòng))、B級(jí)(慢速前向運(yùn)動(dòng))、C級(jí)(非前向運(yùn)動(dòng))、D級(jí)(不活動(dòng))。

1.3.3 睪丸超微結(jié)構(gòu)觀察

大鼠麻醉后在冰臺(tái)上滴加4℃25 mL/L戊二醛固定液，打開(kāi)腹腔，迅速取出睪丸，以銳利薄刀片快速將睪丸切割成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，置4℃ 25 mL/L戊二醛固定液中浸泡固定，常規(guī)制作透射電鏡標(biāo)本，在透射電子顯微鏡下觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)。

1.3.4 睪丸氧化損傷指標(biāo)的觀察

將大鼠睪丸去被膜、脂肪和血管，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，加9倍體積的生理鹽水，用玻璃勻漿器在冰浴條件下研磨6 min制成睪丸勻漿，然后在低溫(4℃)下以2 000 r/min離心15 min，靜置片刻，取上清液，分別按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明測(cè)定蛋白含量、MDA含量和SOD活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用 LDS－t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 睪丸、附睪系數(shù)和精子計(jì)數(shù)的觀察

高劑量組睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)顯著減小、精子計(jì)數(shù)明顯下降，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其余組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(表1)。

表1 睪丸、附睪系數(shù)和精子計(jì)數(shù)的觀察 (n=10)

2.2 精子活動(dòng)度觀察

高劑量組A、B級(jí)精子數(shù)目減少明顯，C、D級(jí)精子數(shù)目增加顯著，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其余組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(表 2)。

表2 精子活動(dòng)度觀察 (n=10)

2.3 睪丸超微結(jié)構(gòu)觀察

透射電鏡見(jiàn)曲細(xì)精管內(nèi)含不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞，核大而致密，連接緊密;支持細(xì)胞含較多細(xì)長(zhǎng)線粒體，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá);間質(zhì)細(xì)胞常染色質(zhì)明顯，可見(jiàn)脂滴、線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈同心環(huán)狀，低、中劑量組與陰性對(duì)照組基本相同。高劑量組生精上皮排列紊亂，連接疏松，細(xì)胞間隙增大;支持細(xì)胞線粒體腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目減少;間質(zhì)細(xì)胞異染色質(zhì)明顯，線粒體質(zhì)膜皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀疏，溶酶體增多(圖1)。

圖1 睪丸超微結(jié)構(gòu)觀察

2.4 睪丸氧化損傷指標(biāo)的觀察

中劑量組MDA含量升高、CuZn－SOD活力降低，高劑量組MDA含量升高、Mn－SOD活力和Mn－SOD活力下降，與陰性對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，其余組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)(表 3)。

表3 睪丸氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的觀察(n=10，±s)

表3 睪丸氧化損傷相關(guān)指標(biāo)的觀察(n=10，±s)

*與陰性對(duì)照組比較P＜0.05

組別MDA Mn－SOD CuZn－SOD陰性對(duì)照組1.52 ± 0.27 102.71 ±24.98 191.47 ±11.20低劑量組 1.64 ±0.41 91.09 ±22.73 189.29 ±19.46中劑量組 2.99 ±0.51* 96.45 ±21.61 149.89 ±12.25*高劑量組 3.63 ±0.46* 78.99 ±31.01* 130.31 ±19.01*

3 討論

牙周病是一種病因復(fù)雜的微生物感染性疾病，主要以G－菌和厭氧菌感染為主，牙周致病菌直接或間接損傷牙周組織，還激發(fā)宿主的炎性免疫反應(yīng)［1］，嚴(yán)重影響人類的生理和心理健康。一些研究還指出:牙周病與心血管疾?。?］、糖尿病［3］、消化系統(tǒng)疾病、類風(fēng)濕、生殖和妊娠［4－5］等密切相關(guān)。相對(duì)于抗生素的全身應(yīng)用、局部涂布、漱口和沖洗，局部抗菌緩控釋制劑有著明顯的優(yōu)勢(shì)［6］，復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑是根據(jù)牙周病的發(fā)病機(jī)制并結(jié)合緩控釋制劑的優(yōu)點(diǎn)而研制的新藥，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察該藥對(duì)雄性大鼠睪丸的毒性，為進(jìn)一步的臨床研究提供依據(jù)。

睪丸和附睪為雄性生殖系統(tǒng)最主要的器官，睪丸是精子發(fā)生、分化和增殖的場(chǎng)所，附睪為精子的繼續(xù)成熟、貯存提供適宜的環(huán)境，睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)反映了生殖器官的質(zhì)和量，是評(píng)價(jià)藥物毒性的重要指標(biāo)之一［7］;本研究顯示高劑量組睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)減小，說(shuō)明高劑量的制劑及其代謝產(chǎn)物對(duì)睪丸和附睪的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定的影響，由此而導(dǎo)致其質(zhì)量減輕，系數(shù)減小。本研究還發(fā)現(xiàn)高劑量組精子數(shù)量明顯減少，說(shuō)明高劑量的制劑抑制了生精上皮的發(fā)生、分化和增殖、成熟等相關(guān)過(guò)程，導(dǎo)致精子數(shù)量產(chǎn)生不足，數(shù)量減少。

活動(dòng)性能是成熟精子的重要標(biāo)志，活動(dòng)度是精子活動(dòng)質(zhì)量高低的敏感性指標(biāo)［8］。以往研究表明奧硝唑可引起精子活動(dòng)能力下降［9］，本研究結(jié)果表明高劑量制劑A、B級(jí)精子數(shù)目明顯減少，C、D級(jí)精子數(shù)目顯著增加，說(shuō)明具有高活動(dòng)能力的精子數(shù)目減少，而低活動(dòng)能力的精子數(shù)目增多，精子活動(dòng)質(zhì)量受影響，提示高劑量的制劑及其代謝產(chǎn)物可能引起了睪丸和附睪的細(xì)胞代謝異常和功能障礙，導(dǎo)致某些物質(zhì)合成增加或減少，能量生成或轉(zhuǎn)換障礙，影響精子動(dòng)力機(jī)構(gòu)，導(dǎo)致活動(dòng)性能降低。

正常的形態(tài)學(xué)是組織功能的基礎(chǔ):睪丸是一種分化、發(fā)生活躍的組織，除含有一般的細(xì)胞器外，其線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量非常豐富，以保證精子的分化、發(fā)生和成熟［10］。睪丸超微結(jié)構(gòu)顯示高劑量組生精上皮層、間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞均有不同程度的改變，說(shuō)明了這些細(xì)胞器的功能受到影響:線粒體損傷時(shí)可引起能量代謝障礙;滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，合成、轉(zhuǎn)化類固醇激素的功能降低，并且生物轉(zhuǎn)化和解毒作用下降，可進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷［11］，這些損傷導(dǎo)致了生精上皮分化和增殖功能降低，精子活動(dòng)能力下降，同時(shí)支持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、支持作用減弱，間質(zhì)細(xì)胞局部調(diào)節(jié)作用降低，精子生存微環(huán)境受影響。

當(dāng)外源性刺激物進(jìn)入機(jī)體后，機(jī)體可通過(guò)酶和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，如O2－、OH、H2O2、HOCl、NO、O3和單線態(tài)氧等，這些物質(zhì)能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過(guò)氧化形成脂質(zhì)過(guò)氧化物如醛基(如MDA)等，脂質(zhì)過(guò)氧化物不僅把活性氧轉(zhuǎn)換成活性化學(xué)劑，產(chǎn)生鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)放大活性氧的作用;而且通過(guò)脂氫過(guò)氧化物分解，引起細(xì)胞代謝異常和功能障礙，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］，因此MDA含量可反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度。奧硝唑?qū)ΣG丸具有一定的毒性作用:Pang XB等認(rèn)為奧硝唑引起精子活動(dòng)能力的下降與MDA生成量增加有關(guān)［13］。本研究顯示隨著藥物劑量的增加，MDA含量也增加，中、高劑量組MDA升高明顯，與前人的研究一致，說(shuō)明睪丸組織中活性化學(xué)劑和脂氫過(guò)氧化物含量升高，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞代謝異常，功能受損，精子增殖、成熟和能量合成障礙，其數(shù)目減少、活動(dòng)性能降低。

當(dāng)氧自由基產(chǎn)生時(shí)，機(jī)體可通過(guò)酶和非酶抗氧化系統(tǒng)清除過(guò)多的氧自由基，SOD是其中最主要的代表，可清除超氧陰離子自由基，以減少對(duì)細(xì)胞的損傷，SOD活力的高低反映了機(jī)體清除氧自由基的能力［14］。組織內(nèi)存在兩種SOD:Mn－SOD表達(dá)在線粒體中，是歧化線粒體生成的主要抗氧化酶;CuZn－SOD定位于胞漿，Cu參與酶活性中心結(jié)構(gòu)，并傳遞電子，Zn則有支持穩(wěn)定作用［15］。本研究顯示中劑量組CuZn－SOD活力和中、高劑量組Mn－SOD活力、CuZn－SOD活力均有不同程度的下降，說(shuō)明機(jī)體清除氧自由基能力下降，細(xì)胞呼吸鏈相關(guān)酶類、電子載體等合成、傳遞受阻，線粒體歧化生成減少，能量轉(zhuǎn)換障礙，胞漿中酶活性中心結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，物質(zhì)代謝受影響，繼而造成代謝異常和功能紊亂，甚至發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變。

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The testicular toxicity of ornidazole and pefloxacin mesylate containing，sustained－release periodontaldrug on SD male rats

DONG Zheng－mou，LIU Lu－chuan，AN Jian－ping，LIU Ning，LIU Rui，ZHOU Xia，YE Li－jun
(Department of Stomatology，Institute of Field Surgery，Daping Hospital，the Third Military Medical University，Chongqing 400042，China)

AIM:To investigate the testicular toxicity of a ornidazole and pefloxacin mesylate containing，sustained－release periodontal compound on male rats.METHODS:A total of 40 male SD rats were randomlydivided into negative control，low－，medium－and high－dosegroups by randomdigits table，with 10 animals in eachgroup.The rats of low－，medium－and high－dosegroups were feddaily with the sustained releasedrug at 1，4，and 8g/kg respectively，and those of the negativegroup were feddaily withdistilled water，for 42 consecutivedays.Then all rats were killed after success mating.The coefficient of testis and epididymis，sperm count and movement，testicular ultrastructure，malondialchehyche(MDA)content and superoxidedismutase(SOD)activity in testis weredetermined.RESULTS:Coefficient of testis and epididymis，sperm counting and sperm mobility were significantly reduced in high－dosegroup(P ＜0.05).In addition，ultrastructuraldamage was observed.In both medium－dose and high－dosegroups，MDA content increase and CuZn－SOD activitydecrease were significant(P ＜0.05).But significant Mn－SOD activitydecrease wasdetected only in high－dosegroup(P ＜ 0.05).CONCLUSION:The sustained－release，ornidazole and pefloxacin mesylate containing，periodontal compound has certain testis toxicity.The underlying mechanism might be the increased MDA content anddecreased SOD activity.

Sustained－release periodontal preparation;testis;ultrastructure;oxidativedamage

R781.4

A

1005－2593(2011)01－0019－05

2010－08－13;

2010－12－08

重慶市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(CSTC 2009AC5019)

董正謀(1973－)，男，漢族，湖北紅安人。碩士生(導(dǎo)師:劉魯川)，主治醫(yī)師

劉魯川，E －mail:LiuLuchuan1957@126.com

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