大豆異黃酮對雌鼠初情期等生殖性狀的影響

尹艷云，鮑文玉，倪和民，劉云海，郭 勇，張鴻波，王曉霞

（1.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；2.首都師范大學(xué)，北京 100048）

大豆異黃酮主要是從大豆和豆科植物中提取的一種黃酮類物質(zhì)，因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與雌二醇相似，且可與體內(nèi)的雌激素受體競爭性結(jié)合，發(fā)揮雌激素和抗雌激素作用，因此被稱之為植物性雌激素。在嚙齒實(shí)驗(yàn)動物的養(yǎng)殖中，大豆是蛋白的主要來源，也是大豆異黃酮的主要來源。日糧中大豆含量直接決定了異黃酮的含量。有研究表明通過注射、灌胃或飼料添加特定劑量的大豆異黃酮可以影響母鼠的體重和泌乳量［1］、公鼠的睪丸重和精液的品質(zhì)［2］等。但是標(biāo)準(zhǔn)日糧中常規(guī)劑量異黃酮對雌鼠的初情期和生殖生理指標(biāo)的影響，目前國內(nèi)未見有報道。因此，在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計中，用酪蛋白完全替代富含大豆異黃酮的大豆和苜蓿作為標(biāo)準(zhǔn)日糧中的主要蛋白質(zhì)添加成份，并在標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加不同濃度的大豆異黃酮作為實(shí)驗(yàn)組飼料，飼喂不同時間后通過檢測小鼠的陰道開張日期以及初次配種日期、雌鼠性成熟期（約45日齡）、體成熟期（約65日齡）血清中雌激素含量、體重、子宮重及輸卵管重和雌鼠子宮上雌激素受體表達(dá)的陽性率而了解大豆異黃酮對小鼠某些生殖生理指標(biāo)的影響，以期為動物飼料生產(chǎn)提供一定的參考。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和分組

本試驗(yàn)選用21日齡ICR雌鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司），體重12 g左右，動物許可證號為SCXK（京）2002-2003。雌鼠自由飲水采食，室溫控制在18℃ ～22℃，濕度在40％ ～70％，光照時間14L：10D。斷奶雌鼠隨機(jī)平分3組，斷奶當(dāng)日開始飼喂含不同濃度異黃酮（0 mg/kg，50 mg/kg，400 mg/kg）的飼料。

1.2 試劑與藥品

小鼠雌二醇96孔板試劑盒（美國ADL公司），葡萄糖、NaCl等無機(jī)試劑均為國產(chǎn)優(yōu)級純產(chǎn)品，其余化學(xué)藥品和試劑均購于Sigma公司。40％大豆異黃酮（北京華清美恒生物有限公司）。實(shí)驗(yàn)動物飼料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所生產(chǎn)。羊抗兔IG-g抗體（武漢博士德生物有限公司）。

1.3 陰道開張時間和初次配種時間的確定

幼鼠從斷奶開始，每天 20∶00將雌鼠與公鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，10～12周齡）按2～3∶1比例放同一籠中，次日8∶00檢查記錄每組母鼠的陰道開張情況和陰道栓情況。

1.4 雌鼠45、65日齡血清中雌激素含量、體重、子宮重及卵巢重

在雌鼠45日齡和65日齡時，麻醉雌鼠稱量體重、子宮和卵巢重，心臟取血，室溫下析出血清，離心（4000 r/min，20 min），-20℃保存，試劑盒檢測血清中雌激素濃度。

1.5 免疫組織化學(xué)染色及定量分析雌鼠子宮上皮雌激素受體表達(dá)的陽性率

本實(shí)驗(yàn)利用SABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。小鼠喂養(yǎng)大豆異黃酮8周后每組各取10只脫臼處死，取子宮組織，組織經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋切片。石蠟切片脫蠟至水后入3％-H2O2室溫孵育30 m in，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶；分別用兔抗鼠的一抗（1∶200）孵育切片（4℃，過夜）；再用生物素化的羊抗兔二抗孵育30 m in，37℃；DAB顯色5～10 m in。每步驟間用0.01 mol/L PBS充分洗滌，常規(guī)脫水、透明、封片，鏡下觀察、拍照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值表示，使用 DPS3.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 大豆異黃酮對母鼠陰道開張時間的影響

從表1中可以看出對照組雌鼠從25日齡時開始出現(xiàn)陰道開張，30日齡時所有雌鼠陰道全部開張，50 mg/kg劑量組雌鼠在24日齡時開始出現(xiàn)陰道開張，比對照組早一天；400 mg/kg劑量組雌鼠在28日齡時所有雌鼠陰道全都開張完畢。各組平均日齡分別為

27.2 d，26.1 d和25.8 d，400 mg/kg組顯著早于對照組（P＜0.05），但實(shí)驗(yàn)組間差異不顯著。

2.2 大豆異黃酮對雌鼠最早見栓日齡的影響

表2顯示，從26日齡開始，實(shí)驗(yàn)組和對照組雌鼠開始發(fā)情，發(fā)情日齡分別集中在30.8 d，30.8 d和30.7 d，各組間差異不顯著（P＞0.05）。

表1 各處理組雌鼠陰道開張日齡情況Tab.1 Day of vaginal opening formice treated with soy isoflavones

表2 不同喂養(yǎng)組雌鼠見栓時間Tab.2 Vaginal plug for mice after treatment with soy isoflavones

2.3 大豆異黃酮對45、65日齡雌鼠血清中雌激素含量的影響

采集45日齡和65日齡雌鼠（每次采血每組樣本量30，雌鼠麻醉后稱其體重，心臟采血，采血后雌鼠處死，并稱量子宮、卵巢等重量）的血清，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清中雌二醇的含量。利用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出各孔的雌激素含量。

圖1顯示，在雌鼠45日齡時，各組血清中雌激素含量分別為635 pg/m L、694 pg/m L、703 pg/m L，各組間差異不顯著；在65日齡時，雌鼠血清中雌激素含量分別為460 pg/m L、421 pg/m L、336 pg/m L，各組間差異不顯著。65日齡激素含量400 mg/kg劑量組低于對照和50 mg/kg劑量組，65日齡各組激素總體水平低于45日齡總體水平。

圖1 不同日齡血清雌激素含量Fig.1 Serum estradiol content of all treatment groups

2.4 45、65日齡雌鼠體重和生殖器官重的影響

表3顯示45日齡時雌鼠的體重實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組，子宮重、卵巢重各組之間差異均不顯著； 65日齡時，400 mg/kg劑量組的體重顯著高于對照組，但是其它指標(biāo)差異不顯著。

2.5 大豆異黃酮對雌鼠子宮上雌激素受體表達(dá)的影響

表4中數(shù)據(jù)顯示在雌鼠子宮的間質(zhì)細(xì)胞中，對照組雌激素受體的陽性表達(dá)率顯著低于兩個試驗(yàn)組；400 mg/kg劑量組在腺上皮中的陽性表達(dá)率顯著高于50 mg/kg劑量組和對照組；但是在腔上皮中，各組間受體的陽性表達(dá)率差異不顯著。染色結(jié)果見彩插2圖2。

3 討論

3.1 大豆異黃酮對雌鼠發(fā)情的影響

母鼠生長發(fā)育到一定的年齡時開始出現(xiàn)發(fā)情和排卵而進(jìn)入初情期，這是性成熟的初級階段。初情期以前母鼠的生殖道和卵巢增長較慢，陰腔處于封閉狀態(tài)，不表現(xiàn)性活動。初情期以后，隨著第一次發(fā)情和排卵，生殖器官的大小和重量迅速增長，性機(jī)能也隨之發(fā)育。大約4周齡時陰腔張開，進(jìn)入初情期，陰道開張是小鼠進(jìn)入性成熟的一個重要階段和標(biāo)志，國內(nèi)外許多研究人員均用陰道開張與否判斷小鼠的性成熟情況。

表3 各組雌鼠45、65日齡體重、子宮重、卵巢重Tab.3 Body weight and generative organ weight of all groups

表4 雌鼠子宮上雌激素受體的表達(dá)分布Tab.4 ER express on the uterus of all groups

內(nèi)源性的雌激素在雌性動物身上發(fā)揮極其重要的作用，可使雌性動物表現(xiàn)第二性征，刺激并維持生殖道的發(fā)育。在家畜繁殖上注射適量的雌二醇可以提高發(fā)情率［3］。大豆異黃酮與雌二醇有相似的結(jié)構(gòu)，是一種具有弱雌激素作用的植物雌激素，它能與內(nèi)源性雌激素受體（ER）結(jié)合發(fā)揮微弱的雌激素效應(yīng)［4］。本實(shí)驗(yàn)中我們在幼鼠斷奶當(dāng)日開始飼喂含不同濃度大豆異黃酮的飼料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組與50 mg/kg組沒有顯著差異，這與 Wendy N［5］的研究結(jié)果一致；他們在實(shí)驗(yàn)中，給剛出生1～5日齡CD1幼鼠每日注射0.5，5和50 mg/kg.W.的染料木黃酮，觀察雌鼠初情期陰道開張和合籠后查出陰道栓日齡情況，這兩項檢測指標(biāo)各組之間均差異不顯著。但本實(shí)驗(yàn)中400 mg/kg處理組雌鼠的陰道開張時間比對照組顯著提前，這說明飼料中異黃酮濃度在較400 mg/kg時的類雌激素作用，刺激了母鼠的陰道發(fā)育和開張，但是對雌鼠初次交配日齡上沒有明顯的影響作用。大豆異黃酮具有和染料木黃酮不同的類雌激素效應(yīng)，很有可能是因?yàn)榇蠖巩慄S酮混合物中各種成分與雌激素受體結(jié)合共同或者協(xié)同發(fā)揮的類雌激素效應(yīng)要優(yōu)于染料木黃酮。這也有可能與給予實(shí)驗(yàn)動物植物雌激素的方式、作用時間長短、或者試驗(yàn)動物的種類和年齡不同有關(guān)。

3.2 大豆異黃酮對雌鼠血清中雌激素水平和生殖器官重量的影響

為了檢測異黃酮是否對性成熟和體成熟時期的雌鼠發(fā)情產(chǎn)生影響，我們分別在雌鼠45日齡和65日齡時檢測了血清中的雌激素水平。結(jié)果顯示，在不同階段相同日齡時，各組間雌激素含量水平差異不顯著，這與Wendy N等的研究結(jié)果一樣。但是本實(shí)驗(yàn)65日齡時各組總體雌激素水平要顯著低于45日齡時雌激素水平，這說明雌鼠在65日齡時本身體內(nèi)雌激素水平要低于45日齡時。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)65日齡時隨著飼料中大豆異黃酮濃度的增加小鼠血清中雌激素含量呈遞減趨勢，這可能是因?yàn)殡S著體內(nèi)植物雌激素水平的不斷升高，濃度增加，其與雌激素受體結(jié)合的能力高于內(nèi)源性雌激素水平，從而影響了激素性腺軸，抑制了內(nèi)源性雌激素的分泌，導(dǎo)致內(nèi)源性雌激素水平的下降。

卜云［6］等研究中發(fā)現(xiàn)口服 100 mg/kg和50 mg/kg的異黃酮會抑制小鼠子宮和卵巢的發(fā)育，HaiBinWang［7］等研究中指出飼料中 50 mg/kg、400 mg/kg的異黃酮對母鼠體重?zé)o影響而對子宮重有顯著刺激作用。龍瑞［8］等的研究中發(fā)現(xiàn)給斷奶鼠飼料中添加50 mg/kg大豆異黃酮可以增加雌鼠的體重，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無論是45日齡還是65日齡時，50 mg/kg和400 mg/kg的大豆異黃酮都顯著增加了母鼠的體重，但是對子宮重輸卵管重等都沒有顯著的影響。結(jié)合雌激素含量我們推測45日齡（性成熟時期）前雌鼠體內(nèi)吸收的植物雌激素不斷積累，刺激了雌鼠體重增加同時也增加了雌激素的含量。45日齡后，由于體內(nèi)植物雌激素增加，競爭性結(jié)合體內(nèi)雌激素受體，影響了垂體促性腺軸，從而抑制了內(nèi)源性雌激素的分泌，到65日齡時（體成熟時期）隨著飼料中異黃酮含量的增加，而雌鼠體內(nèi)的雌激素卻呈下降趨勢。

3.3 大豆異黃酮對小鼠子宮雌激素受體表達(dá)分布的影響

以前的研究證明雌激素受體不僅分布在生殖系統(tǒng)，也分布于其他系統(tǒng)的組織，如心臟和血管。雌激素受體的表達(dá)是受雌激素的調(diào)控的。夏紅［9］的研究中發(fā)現(xiàn)將鼠的卵巢切除后，其動脈中ER的含量減少，而補(bǔ)充適量外源性雌激素后ER的表達(dá)量就會維持在卵巢切除前水平，當(dāng)補(bǔ)充大量的外源雌激素后ER表達(dá)量則會顯著的增加，且高于正常水平。本實(shí)驗(yàn)中在給小鼠投喂不同濃度的異黃酮8周（76日齡）后，400 mg/kg組子宮間質(zhì)和腺上皮ER陽性率顯著高于對照組和50 mg/kg組，這與夏紅的研究結(jié)果類似，但是在腺上皮中50 mg/kg組要低于對照組，腔上皮中各組差異不顯著。由此我們可以推測，外源性的雌激素異黃酮不僅可以影響子宮ER的表達(dá)，而且對子宮間質(zhì)和腺上皮中ER的表達(dá)的影響要顯著大與對腔上皮的影響。

4 結(jié)論

飼料中的大豆異黃酮具有類雌激素作用，當(dāng)飼料中的大豆異黃酮量高于400 mg/kg時不僅可以促進(jìn)雌鼠陰道的發(fā)育開張，增加母鼠的體重，還可以顯著影響子宮間質(zhì)和腺上皮中雌激素受體的分布表達(dá)。在蛋白飼料中大豆原料中大豆異黃酮含量大約為2000μg/g［10］，而小鼠的飼料中蛋白含量一般在18％ ～25％［11］，飼料中蛋白如果只由大豆原料來提供的話，飼料中大豆異黃酮的含量就會超過400 mg/kg，從而會影響母鼠的某些生殖生理指標(biāo)，因此，建議在小鼠的飼料生產(chǎn)中飼料蛋白應(yīng)由大豆蛋白結(jié)合其它非大豆蛋白來提供。

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