未凈化Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠封閉群繁育及遺傳穩(wěn)定性分析

李長(zhǎng)龍，石巧娟，盧領(lǐng)群，柯賢福，戴方偉，薩曉嬰

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013）

長(zhǎng)爪沙鼠（Mongolian Gerbil，Meriones unguiculatus）俗稱蒙古沙鼠，屬于嚙齒目，倉(cāng)鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，又稱長(zhǎng)爪沙土鼠、蒙古沙鼠和黃耗子等，野生長(zhǎng)爪沙鼠主要分布于我國(guó)內(nèi)蒙古及其毗鄰的干旱和半干旱地區(qū)［1］，是一種正在開(kāi)發(fā)的“多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物”，現(xiàn)已廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)菌學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、脂類(lèi)和糖代謝、腫瘤學(xué)等研究中具有極為重要的價(jià)值［2-4］。1935年日本學(xué)者從我國(guó)東北和蒙古東部捕捉野生長(zhǎng)爪沙鼠并在大連衛(wèi)生所馴養(yǎng)，后經(jīng)日本北里研究所的長(zhǎng)野博士和日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心研究所野村博士進(jìn)一步馴化和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，后引種到美、英、法等國(guó)。20世紀(jì)60年代開(kāi)始作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。日本國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（NIBIO）現(xiàn)已培育成3個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠近交系，主要由無(wú)毛、白化和癲癇敏感等品系［5］。我國(guó)有兩個(gè)主要的長(zhǎng)爪沙鼠群體，分別保存于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和首都醫(yī)科大學(xué)［1］。浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心從1978年從內(nèi)蒙古捕捉野生長(zhǎng)爪沙鼠并開(kāi)始人工繁殖，經(jīng)過(guò)30多年的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究，培育出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的未凈化長(zhǎng)爪沙鼠封閉群-Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠［6］。該群體目前是國(guó)內(nèi)種群維持時(shí)間最長(zhǎng)、應(yīng)用單位最多、使用量最大、基本生物學(xué)特性研究較為完整的群體［1］。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，m tDNA）是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)。與核基因組相比，線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快（核基因的5～10倍），呈嚴(yán)格的母性遺傳，遺傳行為相對(duì)獨(dú)立，變異發(fā)生的幾率相對(duì)穩(wěn)定、無(wú)組織特異性、提取方便［7］。由于mtDNA的這些獨(dú)特遺傳特性，已被廣泛地用于物種起源與進(jìn)化、生物分類(lèi)、及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究［8-10］。在進(jìn)化分析時(shí)，研究者往往選擇不同的區(qū)域進(jìn)行不同時(shí)間尺度的進(jìn)化分析。線粒體控制區(qū)（D-Loop region）是m tDNA中進(jìn)化最快、變化最復(fù)雜的區(qū)域，其高突變率以及母系遺傳方式使之成分析具有血統(tǒng)關(guān)系的群體內(nèi)遺傳穩(wěn)定性有效的遺傳標(biāo)記［11］。管敏強(qiáng)等［12］利用線粒體控制區(qū)來(lái)分析封閉群小鼠的遺傳穩(wěn)定性。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測(cè)主要是以生化標(biāo)記和基因多態(tài)性為主。線粒體控制區(qū)高度的種內(nèi)群體遺傳多態(tài)性特點(diǎn)，使之成為遺傳檢測(cè)的有效方法［13］。本文利用線粒體 D-Loop區(qū)高突變率的特點(diǎn)，分析本中心未凈化Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠的遺傳穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源及繁育方案

浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心1978年從內(nèi)蒙古捕捉野生長(zhǎng)爪沙鼠，采用國(guó)際上培育遠(yuǎn)交封閉群品系的方法-組間循環(huán)交配法，進(jìn)行封閉馴養(yǎng)、繁殖、選育，維持種群，經(jīng)過(guò)將近30多年，46代封閉選育，已育成一個(gè)特性穩(wěn)定，繁殖性能高的未凈化長(zhǎng)爪沙鼠新品系，定名為Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠，并通過(guò)浙江省創(chuàng)新科技成果鑒定。

1.2 飼養(yǎng)條件和生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定

繁殖群動(dòng)物與生產(chǎn)群動(dòng)物均飼養(yǎng)在未凈化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施中。采用排氣扇自然通風(fēng)方式，氨氣濃度控制在 20 mg/m3以下；自然采光；工作照度為150～300 lux；噪聲控制在69 dB以下；對(duì)溫濕度進(jìn)行相對(duì)控制，溫度18～30℃，日溫差小于3.5℃；相對(duì)濕度60％ ～90％；門(mén)窗設(shè)計(jì)防野鼠和昆蟲(chóng)的鐵網(wǎng)；整個(gè)環(huán)境以及墊料、籠具、水瓶定期用新潔爾滅、百毒殺、過(guò)氧乙酸等消毒，以控制動(dòng)物特有傳染病和人畜共患病，落下菌數(shù)控制在少于40個(gè)/皿h。我國(guó)目前沒(méi)有長(zhǎng)爪沙鼠飼料標(biāo)準(zhǔn)，我中心在長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程中探索一套出行之有效的飼料配方。在上述營(yíng)養(yǎng)條件下，隨機(jī)選擇40對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠，記錄其繁殖胎次、產(chǎn)子數(shù)等數(shù)據(jù)。記錄其仔鼠的體重和體長(zhǎng)等變化情況。

1.3 遺傳穩(wěn)定性分析

1.3.1 動(dòng)物來(lái)源和基因組 DNA的抽提：Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠來(lái)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)群。選擇遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體的非親代、非同胞的雌鼠33只進(jìn)行試驗(yàn)。所有個(gè)體采集肝臟組織樣低溫保存，采用常規(guī)苯酚、氯仿提取基因組DNA，DNA樣品稀釋50 ng/μL備用。

表1 Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠飼料營(yíng)養(yǎng)成分Tab.1 The food composition for Mongolian Gerbil

1.3.2 引物合成：按照引物設(shè)計(jì)原則，在長(zhǎng)爪沙鼠線粒體控制區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì) 1對(duì)引物。上游 5＇-TTCC CAGGACATCAAGAAGG-3＇，下游 5＇-GGGTGTGGC TAGGCTAAGTG-3＇。引物均由上海美吉生物技術(shù)有限公司合成。

1.3.3 PCR擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中含有基因組 DNA約 50 ng，0.20 mM的引物，200 mM的 dNTPs，2.0 mM，1.0 UTaq DNA聚合酶（TaKaRa Biotech，China）。擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃ 4 min；變性94℃ 45 s，退火60℃ 1 min，延伸72℃1 m in，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 延伸8 m in。

1.3.4 測(cè)序和比對(duì)：擴(kuò)增產(chǎn)物按照DNA片段純化試劑盒（Tiangen Biotech，China）說(shuō)明書(shū)方法純化，純化產(chǎn)物送上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接并與已發(fā)表的長(zhǎng)爪沙鼠線粒體控制區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)［14］，發(fā)現(xiàn)可疑的變異位點(diǎn)后用Chormas軟件讀取測(cè)序的峰圖記進(jìn)一步分析確認(rèn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)繁殖情況

Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠屬于雜食性動(dòng)物，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)基地）生產(chǎn)的顆粒飼料（包括：繁育飼料和育成飼料）能夠夠滿足長(zhǎng)爪沙鼠的營(yíng)養(yǎng)需求，飼喂效果較好，經(jīng)過(guò)近30年的飼喂，長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，成年長(zhǎng)爪沙鼠毛色光亮，運(yùn)動(dòng)敏捷，未發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)不良情況。

據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，長(zhǎng)爪沙鼠一夫一妻交配行為較明顯，離乳后應(yīng)選擇生長(zhǎng)發(fā)育良好的仔鼠進(jìn)行配對(duì)，以保證后代的質(zhì)量。長(zhǎng)爪沙鼠是多次發(fā)情動(dòng)物，在人工飼養(yǎng)條件下可全年交配繁殖。統(tǒng)計(jì)40對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠，共計(jì)455胎產(chǎn)子情況（見(jiàn)圖1），其平均每胎產(chǎn)仔7.01只，且每胎產(chǎn)仔數(shù)大多在5～9只，占總胎數(shù)的79.34％。從胎間隔上看：觀察100對(duì)母鼠不同生產(chǎn)胎次的間隔，胎間隔最短20 d，最長(zhǎng)127 d，胎間隔大多在20～60 d之間，占總數(shù)的72.16％。在繁殖期內(nèi)，有時(shí)發(fā)生配對(duì)雌（或雄）鼠死亡，補(bǔ)充配對(duì)時(shí)，往往發(fā)生咬斗現(xiàn)象，甚至咬傷致死，隨著培養(yǎng)代數(shù)的增加，這種咬斗現(xiàn)象減少，持續(xù)時(shí)間亦縮短。長(zhǎng)爪沙鼠和大小鼠一樣，有產(chǎn)后即時(shí)交配受孕的特性。

圖1 長(zhǎng)爪沙鼠每胎產(chǎn)子數(shù)及其比例Fig.1 Number of birth and the ratio in Mongolian Gerbi

長(zhǎng)爪沙鼠仔鼠出生后測(cè)量體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)，觀測(cè)到116 d。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：長(zhǎng)爪沙鼠從出生到26 d體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)的增長(zhǎng)比較平穩(wěn)，在26 d～95 d的時(shí)間里，沙鼠各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的增長(zhǎng)較快，95 d后增長(zhǎng)又趨于平穩(wěn)，甚至停止。這與沙鼠的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律相符。從體重和體長(zhǎng)指標(biāo)上比較發(fā)現(xiàn)，在離乳前雌、雄差異不明顯，離乳后的整個(gè)發(fā)育期，雄鼠的體重和體長(zhǎng)均大于雌鼠（詳見(jiàn)圖2～3）。

圖2 長(zhǎng)爪沙鼠日齡和體重Fig.2 Age and weight body in Mongolian Gerbil

圖3 長(zhǎng)爪沙鼠日齡和體長(zhǎng)Fig.3 Age and stem length in Mongolian Gerbil

2.2 遺傳學(xué)穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果：33只長(zhǎng)爪沙鼠DNA樣品全部擴(kuò)增出特異性條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期產(chǎn)物片段大小基本一致（圖4）。

2.2.1 多態(tài)性分析：測(cè)序結(jié)果顯示，33只Z：ZCLA

長(zhǎng)爪沙鼠線粒體D-Loop序列完全一致，與之前報(bào)道的長(zhǎng)爪沙鼠無(wú)任何差別。未見(jiàn)序列多態(tài)性和序列不穩(wěn)定性（圖5，圖6）

圖4 D-Loop區(qū)域擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖（部分） M：DNA DL5000 MarkerFig.4 The product of PCR in agarose gel electrophoresis

3 討論

圖5 D-Loop區(qū)域測(cè)序峰圖（部分）Fig.5 The result of campare in sequence from gerbil（partical）

圖6 D-Loop區(qū)域擴(kuò)測(cè)序結(jié)果比對(duì)圖（部分）DNAMAN 5.5 Fig.6 The result of campare in sequence from gerbil（partical）

Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠是國(guó)內(nèi)第一個(gè)從野生長(zhǎng)爪沙鼠培育成功的、維持時(shí)間最長(zhǎng)、使用最廣、生物學(xué)特性研究較系統(tǒng)的特性穩(wěn)定、繁殖率高的長(zhǎng)爪沙鼠封閉群新品系，屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。目前Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠已被浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上海第二軍醫(yī)大學(xué)、重慶第三軍醫(yī)大學(xué)、徐州醫(yī)學(xué)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院等十幾個(gè)單位用于寄生蟲(chóng)、腦出血、微生物學(xué)、脂類(lèi)和糖類(lèi)代謝方面的研究，取得了重大科技成果。特別是浙江省疾病預(yù)防控制中心朱智勇研究員在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠是流行性出血熱病毒（EHFV）敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是研究EHFV特性和疫苗研制的首選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。利用Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠腎細(xì)胞作培養(yǎng)基質(zhì)，在世界上首創(chuàng)流行性出血熱疫苗（I類(lèi)），獲國(guó)家科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司已使用60萬(wàn)多只Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠生產(chǎn)流行性出血熱疫苗用于防病，取得十分顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

遺傳質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制的重要組成部分，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性和可重復(fù)性提供可靠的保證。利用m tDNA分析小鼠的遺傳穩(wěn)定性已有報(bào)道，如用PCR-RFLP和PCR-SSCP技術(shù)對(duì)近交系小鼠、封閉群小鼠 mtDNA的 D-Loop、tRNA（Met+Glu+Ile）和ND3基因部分序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)品系內(nèi)、品系間均表現(xiàn)出相同的酶圖譜［15-16］。但是PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)DNA多態(tài)性具有一定的局限性，所包含的遺傳信息量較少，因此對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而言，PCR-RFLP技術(shù)不是一種理想的遺傳檢測(cè)手段。直接測(cè)序法能夠直接分析DNA的變異，包含完整的遺傳信息。管敏強(qiáng)（2009）［12］利用直接測(cè)序法測(cè)定封閉群ICR小鼠的m tDNA序列并分析其遺傳穩(wěn)定性。

線粒體DNA沒(méi)有組蛋白保護(hù)和DNA修復(fù)系統(tǒng)，是所有的突變均能夠保存下來(lái)，因此其突變頻率比核DNA高的多，多態(tài)信息含量豐富。D-Loop區(qū)域是m tDNA中突變頻率最高的區(qū)域，在人群和動(dòng)物種群內(nèi)均具有豐富的多態(tài)性［17-18］。作者曾首先對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠線粒體DNA控制區(qū)的DNA序列進(jìn)行克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠D-Loop共包括997 bp，在嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中與大鼠和小鼠具有較近的遺傳關(guān)系［14］。為了分析我單位Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠遺傳穩(wěn)定性，隨機(jī)選擇非同胞、非親代的33只個(gè)體Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠的m tDNA D-Loop區(qū)的序列多態(tài)性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)序列突變，與前期報(bào)道的序列完全一致，推測(cè)Z：ZCLA長(zhǎng)爪沙鼠群體內(nèi)遺傳變異頻率較低，穩(wěn)定性較高。

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