扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究*

張 韌 王丁超 蘇秀平 高 翔 王 靜 吳桂玲 陳曉敏

1河南省濮陽市中醫(yī)院（河南濮陽457003）

2河南省中醫(yī)院（河南鄭州450008）

急性肺損傷（ALI）是臨床上常見的急性呼吸系統(tǒng)功能失常，其中由感染導(dǎo)致的膿毒血癥是引起ALI的最常見的病因。目前認(rèn)為膿毒癥是炎癥失控導(dǎo)致的紊亂，是機(jī)體對微生物產(chǎn)物發(fā)生失控的免疫反應(yīng)［1］，其中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是膿毒癥發(fā)生早期的重要炎性細(xì)胞因子，大量釋放則對機(jī)體造成損傷，白細(xì)胞介素-1（IL-1）可與 TNF-α 協(xié)同作用加重多器官損傷［2］。 本實(shí)驗(yàn)以膿毒癥大鼠為研究對象，觀察大鼠不同時間點(diǎn)的肺組織含水量、動脈血?dú)庾兓⒎谓M織IL-1、TNF-α表達(dá)變化，探討中藥復(fù)方扶正敗毒顆粒對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 青年SD大鼠，清潔級，雌雄各半，鼠齡3～4月，體質(zhì)量（300±50）g，154只。 由河南實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：scxk（豫）2009-0006。

1.2 藥品與儀器 扶正敗毒顆粒（濮陽市中醫(yī)院中藥制劑室提供）；烏司他丁（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準(zhǔn)字 S19990050）；IL-1單克隆抗體及TNF-α單克隆抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供。光學(xué)顯微鏡（Olympus optical Co.LTD，JAPAN，型號 PM-10AD）。電子天平（上海精科天平廠，型號 JA1203）。

1.3 分組與造模 將SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、扶正敗毒顆粒組、烏司他丁組及扶正敗毒顆粒聯(lián)合烏司他丁聯(lián)合組（聯(lián)合組）各36只，假手術(shù)組10只。參考文獻(xiàn)［3-4］加以改良制備膿毒癥動物模型。水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，待完全麻醉后，仰臥位固定大鼠，頸部皮膚常規(guī)備皮、消毒，于頸外側(cè)下頜至心臟的中點(diǎn)作一約1cm的橫切口，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸外靜脈，沿血管向近心端方向插入留置針約1cm，將導(dǎo)管從留置針管與頸外靜脈夾孔中把心導(dǎo)管慢慢置入達(dá)右心房，結(jié)扎固定，導(dǎo)管末端經(jīng)皮下隧道從頸后中央引出并固定于皮膚，管內(nèi)注射125U/mL肝素0.5mL抗凝，插入置管針封閉導(dǎo)管。然后沿腹白線中段作3cm切口，探查取出盲腸，用4號絲線距盲端1cm處結(jié)扎，用12號針穿刺3孔，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫（37.0±0.5）℃，保持室溫（26.0±1.0）℃。

1.4 給藥方法 假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組分別于造模后第1日用生理鹽水灌胃，同時扶正敗毒顆粒組、聯(lián)合組用扶正敗毒顆粒（36.8mg/100g）灌胃（灌胃容積為1mL/100g），每日灌胃1次直至取材；烏司他丁組、聯(lián)合組大鼠分別于造模后第1日腹腔內(nèi)注射烏司他?。?萬U/㎏），假手術(shù)組、模型組、扶正敗毒顆粒組同時用同等容積的生理鹽水腹腔注射，每日1次直至取材。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 （1）腹主動脈血?dú)猓簻y定大鼠口腔溫度，并記錄，取腹主動脈血2mL采用電極法進(jìn)行血?dú)鉁y定，PaO2、PaCO2。（2）肺組織含水量：稱取肺組織濕重，然后放入恒溫箱（100±2℃）干燥，24h后取出，稱取干重，計(jì)算肺組織含水量。計(jì)算公式：肺組織含水量=（肺濕重-肺干重）/肺濕重×100%，以%表示。（3）臟器組織IL-1，TNF-α表達(dá)：檢測采用免疫組織化學(xué)SP法檢測，在400倍光鏡下觀察，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕色為免疫組化陽性；用Image-Pro Plus 5.1專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像，并進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個視野拍照，測定其平均吸光度及陽性細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。（4）病理觀察：取肺組織4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4～6μm厚的切片，常規(guī)脫蠟、脫水，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡觀察肺、腸組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用單因素方差分析方法，數(shù)據(jù)以s）表示；組內(nèi)差異比較采用單因素方差分析兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組動脈血 PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組PaO2升高，PaCO2下降，以聯(lián)合7d組尤為顯著（P＜0.01）；與扶正敗毒顆粒通組比較，烏司他丁組無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 （mmHg，

表1 各組大鼠動脈血PaO2、PaCO2比較 （mmHg，

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01； 與模型組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01；與扶正敗毒顆粒組比較，▽P＜0.05；與聯(lián)合組比較，〇P＜0.05，〇〇P＜0.01；與 2d組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01；與 3d組比較，*P＜0.05，*P＜0.01。 下同。

?

2.2 肺組織含水量變化結(jié)果 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織含水量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組含水量均顯著降低 （P＜0.05或0.01），與2d、3d組相比，扶正敗毒顆粒和烏司他丁7d組的肺組織含水量均顯著降低（P＜0.05或0.01），以聯(lián)合7d組下降尤為顯著（P＜0.01）。

表2 各組大鼠含水量比較（

表2 各組大鼠含水量比較（

?

2.3 肺組織TNF-α、IL-1的表達(dá)變化 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1表達(dá)均升高 （P＜0.05或0.01）；與模型組相比，扶正敗毒顆粒和烏司他丁及聯(lián)合組各時間點(diǎn) TNF-α、IL-1的表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.05或 0.01），以聯(lián)合7d組的尤為顯著（P＜0.01）；與聯(lián)合組相比，扶正敗毒顆粒組和烏司他丁組TNF-α、IL-1表達(dá)水均顯著升高 （P＜0.05或0.01），以 2d組尤為顯著（P＜0.01）。與 2d 、3d組相比，以聯(lián)合 7d組 TNF-α、IL-1 表達(dá)水平下降尤為顯著（P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細(xì)胞表達(dá)變化（IOD，

表3 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-1陽性細(xì)胞表達(dá)變化（IOD，

?

2.4 肺組織病理改變 假手術(shù)組大鼠肺組織可見肺泡大一致，肺泡壁菲薄，支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無分物，支氣管上皮正常，外周無炎性細(xì)胞浸潤。模型2d組可見肺間質(zhì)有單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸，肺組織出現(xiàn)散在性病灶；3d組可見病灶增大、數(shù)量多，肺泡壁廣泛淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，有些區(qū)域可見肺泡出血，肺泡壁結(jié)構(gòu)不清。7d組更為明顯，肺泡腔內(nèi)滿布炎性滲出物、血性滲出物明顯，大量上皮脫落，肺泡壁結(jié)構(gòu)不清，大片的肺實(shí)變。扶正敗毒顆粒組在第2、3、7日均較模型組有顯著改善，病變范圍、程度均較模型組明顯減輕。聯(lián)合7d組改善尤為顯著，表現(xiàn)為病變范圍較局限，炎細(xì)胞密度較低，肺泡腔內(nèi)滲出物少，肺泡結(jié)構(gòu)較模型組完整。

3 討 論

ALI主要是因機(jī)體炎癥反應(yīng)失控所導(dǎo)致的器官損傷［5］。本組資料顯示模型組大鼠肺組織炎性因子TNF-α，IL-1表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，表明促炎細(xì)胞因子在膿毒癥大鼠急性肺損傷損傷中發(fā)揮了重要作用。TNF-α是由活化的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有核心作用，是導(dǎo)致炎癥介質(zhì)級聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子。一旦TNF-α被分泌出來，炎癥連鎖反應(yīng)即被啟動，促進(jìn)其他細(xì)胞因子的激發(fā)釋放，引起組織損害。有報(bào)道促炎癥細(xì)胞因子TNF-α在感染性休克中發(fā)揮關(guān)鍵作用，直接導(dǎo)致某些臟器的損傷［6］。IL-1是另一種主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子，是體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，能激活多種免疫和炎癥細(xì)胞：刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α；刺激中性粒細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)；誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化，與TNF-α協(xié)同作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，趨化中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)人病變部位，增加血管內(nèi)皮通透性，加重組織損傷［7-8］。所以，降低促炎細(xì)胞因子TNF-α，IL-1水平對防止ALI具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正敗毒顆粒能夠降低組織炎性因子TNF-α，IL-1表達(dá)水平，提示扶正敗毒顆粒通過降低臟器組織中炎性細(xì)胞因子TNF-α，IL-1含量，進(jìn)而減輕膿毒癥大鼠多器官損傷和降低死亡率。

綜上所述，促炎因子TNF-α，IL-1在ALI中發(fā)揮了重要作用，扶正敗毒顆粒能夠降低臟器組織中TNF-α，IL-1表達(dá)水平以減輕臟器損傷；降低了肺組織的含水量，提高動脈血氧含量，對膿毒癥大鼠具有確實(shí)的防護(hù)作用，為扶正敗毒顆粒防治膿毒癥性MODS提供了參考。

［1］ SatSharma，MD，F(xiàn)RCPC，etal.Septic shock multiple organ failure and acute respiratory distresss yndrome［J］.Medseape，2003，9（12）：199-209.

［2］ 邱海波，潘家綺，趙永強(qiáng)，等.腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2在感染及器官損傷中的作用及治療探討［J］.中國危重病急救醫(yī)學(xué)，1996，8（3）：139-142.

［3］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000：298-335.

［4］ Xiang D Z，Vverbeken K，Vanlommela T，etal.Intimal hyperplasia after long-term venous catheterization［J］.Eur Surg Res，2000，32（4）：236-245.

［5］ 陳海龍，關(guān)鳳林，吳咸中.多器官功能不全綜合征研究的現(xiàn)狀和展望［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2000，20（7）：439.

［6］ Andrzejczak D，Gorska D，Czarnecka E.Influence of amlodipine and atenolol on lipopolysaccharide （LPS）-induced serum concentrations of TNF-alpha，IL-1beta，IL-6inspontaneouslyhypertensiverats （SHR） ［J］.Pharmacol Rep，2006，58（5）：711.

［7］ 孫衛(wèi)民，王惠琴.細(xì)胞因子研究方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：584.

［8］ 羅正曜.休克學(xué)［M］.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2001：601.