益氣補(bǔ)腎中藥對(duì)自然流產(chǎn)模型小鼠CD28分子表達(dá)的影響

陳雪君 浙江省臺(tái)州醫(yī)院 臺(tái)州 317000

葉 平 浙江省中醫(yī)院

胡藍(lán)雅文 黃丹云 丁鍵紅 浙江中醫(yī)藥大學(xué)

益氣補(bǔ)腎中藥對(duì)自然流產(chǎn)模型小鼠CD28分子表達(dá)的影響

陳雪君 浙江省臺(tái)州醫(yī)院 臺(tái)州 317000

葉 平 浙江省中醫(yī)院

胡藍(lán)雅文 黃丹云 丁鍵紅 浙江中醫(yī)藥大學(xué)

目的：觀察益氣補(bǔ)腎中藥對(duì)小鼠母胎免疫的調(diào)節(jié)作用。方法：以CBA雌鼠×DBA/2雄鼠建立小鼠自然流產(chǎn)模型，將20只CBA孕鼠隨機(jī)分成四組，每組5只。空白對(duì)照組（NS組）予生理鹽水灌胃，西藥組予環(huán)孢菌素A（CsA）灌胃，中藥組予益氣補(bǔ)腎中藥灌胃，中西結(jié)合組予中藥+CsA灌胃。妊娠14天處死孕鼠，取脾臟與母胎界面組織，用流式細(xì)胞分析術(shù)（FCM）分析各組孕鼠CD28分子的表達(dá)情況。結(jié)果：CD28分子在脾臟表達(dá)趨勢(shì)從高到低依次為：生理鹽水組、西藥組、中西結(jié)合組、中藥組，各治療組CD28分子表達(dá)均低于NS組（P＜0.05）；CD28分子在母胎界面上表達(dá)趨勢(shì)從高到低依次為：生理鹽水組、中藥組、西藥組、中西結(jié)合組，中西結(jié)合組CD28分子表達(dá)低于NS組、西藥組和中藥組（P＜0.05）；中藥組、西藥組CD28分子表達(dá)均低于NS組（P＜0.05）。結(jié)論：益氣補(bǔ)腎中藥對(duì)自然流產(chǎn)模型小鼠有下調(diào)CD28分子表達(dá)的作用趨勢(shì)。

小鼠 自然流產(chǎn)模型 CD28 益氣補(bǔ)腎 中藥

近年來(lái)，我們臨床選取補(bǔ)中益氣湯加減治療反復(fù)自然流產(chǎn)（SA），取得滿意療效。關(guān)于其在母胎免疫中是否具有調(diào)節(jié)CD28分子表達(dá)的作用，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察益氣補(bǔ)腎中藥應(yīng)用于小鼠自然流產(chǎn)模型小鼠CD28分子的表達(dá)影響，探討益氣補(bǔ)腎中藥對(duì)母胎免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 8～10周齡、性成熟、體重20g左右的雌性CBA小鼠40只，雄性DBA/2小鼠20只。由浙江中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，環(huán)境溫度：（25±1）℃，相對(duì)濕度50%～70%，換風(fēng)次數(shù)15～20次/h，光照150～200Lx，12h明暗交替，噪音＜50dB,自由攝食與飲水。實(shí)驗(yàn)前，先不加任何干預(yù)，將小鼠飼養(yǎng)1周，使其很好地適應(yīng)環(huán)境。

1.2 藥 品 益氣補(bǔ)腎中藥煎劑：黃芪36g，黨參12g，當(dāng)歸6g，陳皮、升麻、柴胡各12g，白術(shù)18g，菟絲子30g，加水濃煎至每毫升湯劑含2g生藥。中藥飲片購(gòu)自浙江省中醫(yī)院中藥房，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥實(shí)驗(yàn)室煎制。密封保存于消毒容器中，置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑 生理鹽水、環(huán)孢菌素A（新山地明，CsA）購(gòu)自浙江省中醫(yī)院中藥房。磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)、RPMI-1640培養(yǎng)液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)）；小鼠淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司生產(chǎn))；FITC Conjugated Anti-mouse CD3e、PE Conjugated Anti-mouse CD28、PE ConjugatedAnti-mouseCD152（CTLA-4）、PE Conjugated Armenian Hamster IgG Isotype Control、PE Conjugated Golden Syrian Hamster IgG Isotype Control（均由美國(guó)eBioscience公司生產(chǎn)）。

1.4 主要設(shè)備與儀器 微量移液槍（0.1-5000μL，德國(guó) Eppendorf公司）；低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（LDZ5-2型，北京京立離心機(jī)有限公司）；漩渦混合器（XW-80A型，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；血球計(jì)數(shù)板（XB-K-25型，上海求精生化試劑儀器有限公司）；光學(xué)顯微鏡（CX31RTSF型，日本OLYMPUS公司）；流式細(xì)胞儀（Facs Calibur基本型，美國(guó)BD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備 將20只雌性CBA小鼠編號(hào)、稱重，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（NS組）、西藥組、中藥組、中西結(jié)合組，每組各5只。與雄性DBA/2小鼠以2：1合籠交配，造自然流產(chǎn)模型。合籠后，每天觀察雌鼠陰栓，見(jiàn)陰栓日為妊娠第0天。

2.2 給藥途徑與劑量 NS組自妊娠第0天開(kāi)始，予生理鹽水10ml/kg灌胃，1天1次。西藥組：妊娠第4天（著床期）予環(huán)孢菌素A10mg/kg灌胃1次。中藥組：自妊娠第0天開(kāi)始，予益氣補(bǔ)腎中藥27g/kg灌胃，1天1次。中西結(jié)合組：自妊娠第0天開(kāi)始，予益氣補(bǔ)腎中藥27g/kg灌胃，1天1次，并在妊娠第4天予環(huán)孢菌素A10mg/kg灌胃1次。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.3.1 標(biāo)本采集 妊娠第14天處死小鼠，75%乙醇消毒后，用眼科剪剪開(kāi)小鼠腹部皮膚肌肉、腹膜，鈍性分離脾臟。鈍性+銳性分離子宮，用鑷子撕開(kāi)子宮，除去胚胎及胎盤，留下子宮及蛻膜組織，即為母胎界面組織。

2.3.2 制備脾臟單細(xì)胞懸液 將取出的脾臟用PBS溶液洗一次后，置于裝有2mL RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中，用1mL注射器抽取RPMI-1640培養(yǎng)液沖打脾臟，至脾臟呈半透明狀，過(guò)200目網(wǎng)篩，制成細(xì)胞懸液。用移液槍將細(xì)胞懸液加至同體積的小鼠淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持液體分層清晰。以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min后，移液槍吸取云絮層，置入裝有4mL RPMI-1640培養(yǎng)液的試管中。搖勻，再以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，棄去上清液。洗滌：加入1mL的PBS溶液，反復(fù)沖打，再以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min后，棄去上清液。重復(fù)洗滌2次后，再加入0.5mL PBS溶液，反復(fù)沖打，制成單細(xì)胞懸液。

2.3.3 制備母胎界面組織單細(xì)胞懸液 將取出的母胎界面組織用PBS溶液洗一次后，置于裝有3mL RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中，剪碎，研磨，過(guò)300目濾網(wǎng)，制成細(xì)胞懸液。余步驟同脾臟單細(xì)胞懸液的制備。

2.3.4 計(jì)數(shù)細(xì)胞 將單細(xì)胞懸液添加到血球計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)節(jié)濃度至1×107/mL。

2.3.5 細(xì)胞染色和流式細(xì)胞分析術(shù)（FCM）分析 取4支試管，編號(hào)為：實(shí)驗(yàn)管（a、b）、對(duì)照管（a、b）。a試管加入100μL脾臟單細(xì)胞懸液，b試管加入100μL母胎界面組織單細(xì)胞懸液，按標(biāo)準(zhǔn)化法標(biāo)記細(xì)胞，見(jiàn)表1。

表1 各管所加單抗與劑量

加抗后用漩渦混合器渦旋振蕩，避光孵育30min后，再每管加入0.5mL PBS溶液洗滌離心一次，棄上清液，然后將細(xì)胞重懸于200μL PBS液中，即刻上機(jī)，用Cell Quest軟件獲取細(xì)胞,每份樣本檢測(cè)1× 105個(gè)細(xì)胞,結(jié)果以CD3+CD28＋T細(xì)胞占CD3＋T細(xì)胞的百分比進(jìn)行計(jì)算。測(cè)試完畢后用Cell Quest Pro軟件分析數(shù)據(jù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包處理分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；組間差異比較采用one-way ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 各組小鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲食、二便、毛發(fā)光澤度等情況均無(wú)殊，未見(jiàn)陰道口流血現(xiàn)象。

3.2 各組間CD28分子的表達(dá)差異 實(shí)驗(yàn)結(jié)果以CD3+CD28＋T細(xì)胞占CD3＋T細(xì)胞的百分比計(jì)算。妊娠14天各組CD28分子表達(dá)情況見(jiàn)表2。

表2 妊娠14天各組CD28分子的表達(dá)情況（ x±s ） %

4 討 論

T輔助（Th）細(xì)胞的功能性分化是近年來(lái)免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，Th細(xì)胞根據(jù)其分化后產(chǎn)生Th1/Th2兩類不同的T輔助細(xì)胞1（Th1）、T輔助細(xì)胞2（Th2）細(xì)胞因子平衡與妊娠結(jié)局關(guān)系密切。Th1、Th2細(xì)胞有著不同的功能。Th1型細(xì)胞因子具有胚胎毒作用，妨礙早期胚胎的發(fā)育，引起妊娠丟失；相反Th2型細(xì)胞因子具有免疫營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)正常妊娠的維持起保護(hù)作用。正常妊娠是以母體向Th2型細(xì)胞因子偏移的體液免疫應(yīng)答；而病理性妊娠如不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)則以向Th1型細(xì)胞因子偏移的細(xì)胞免疫應(yīng)答[1]。

T細(xì)胞的活化除了需要抗原刺激外，還需第二信號(hào)的參與。當(dāng)?shù)谝恍盘?hào)和第二信號(hào)同時(shí)存在時(shí)，T細(xì)胞克隆活化并增殖，產(chǎn)生免疫應(yīng)答；當(dāng)僅有第一信號(hào)而缺乏第二信號(hào)時(shí)，則可誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性無(wú)反應(yīng)(anergy)，被認(rèn)為是造成抗原特異性免疫耐受的重要機(jī)制[2]。

第二信號(hào)的傳遞主要由協(xié)同刺激分子完成，CD28分子是共刺激分子B7分子的受體。CD28主要與B7-1（CD80）結(jié)合，啟動(dòng)T細(xì)胞活化途徑。CD28與T細(xì)胞受體 (TCR)、CD3協(xié)同作用,產(chǎn)生雙刺激信號(hào)以激活T淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)Th細(xì)胞向Th1分化[3]。

中醫(yī)認(rèn)為，自然流產(chǎn)的病因病機(jī)主要有母體沖任損傷和胎元不健兩個(gè)方面。其中又以母體脾腎兩虛最為關(guān)鍵。腎主先天，精藏于腎，而胞脈系于腎，胎元是否鞏固主要責(zé)之腎精、腎氣是否充實(shí)；胎孕已成后不僅需先天生殖之精的滋養(yǎng)和腎氣的鞏固，還有賴于后天水谷之精的充養(yǎng)。脾為后天之本，脾虛運(yùn)化水谷精微不足，必致氣血虧虛，胎失所養(yǎng)，導(dǎo)致胎元不固而損墮。因此，治療上應(yīng)脾腎兼顧。

本實(shí)驗(yàn)所用的益氣補(bǔ)腎方為導(dǎo)師葉平副教授根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合文獻(xiàn)資料研究，由經(jīng)方化裁而來(lái)。方中重用黃芪、菟絲子，兩者共為君藥。黃芪味甘微溫，入脾肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣，升陽(yáng)固表；菟絲子辛、甘、平，入腎、肝、脾經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、安胎之效。黨參、白術(shù)補(bǔ)氣健脾為臣。當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，協(xié)黨參、黃芪以補(bǔ)氣養(yǎng)血；陳皮理氣和胃，使諸藥補(bǔ)而不滯，共為佐藥。并以少量升麻、柴胡升陽(yáng)舉陷，協(xié)助黃芪以升提下陷之中氣，為佐使藥。全方以益氣補(bǔ)腎為主，兼顧健脾養(yǎng)血，達(dá)安胎之效。藥理研究證實(shí)[4]，益氣補(bǔ)腎中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，有利于母胎界面免疫耐受狀態(tài)的維持，是臨床保胎治療的常用藥物。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益氣補(bǔ)腎中藥在妊娠14天，對(duì)于自然流產(chǎn)模型小鼠均有下調(diào)CD28分子在局部表達(dá)的作用（P＜0.05），有下調(diào)CD28分子在全身表達(dá)的作用趨勢(shì)（P＞0.05）。推測(cè)益氣補(bǔ)腎中藥可能通過(guò)下調(diào)CD28分子表達(dá)，減少Th細(xì)胞向Th1分化，維持Th1/Th2平衡，從而有利于妊娠狀態(tài)的維持，降低自然流產(chǎn)發(fā)生率。這在一定意義上，可為臨床上益氣補(bǔ)腎中藥治療SA提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組間觀察指標(biāo)差異雖有一定的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有待于大樣本的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

［1］Wilczynski Jacek R.Immunological analogy between allograft rejection,recurrent aborti-on and pre-eclampsia the same basic mechanism［J］.Human Immunology，2006,67（7）: 492-511.

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［3］金莉萍，李大金，王明雁，等.孕早期干預(yù)協(xié)同刺激信號(hào)誘導(dǎo)自然流產(chǎn)模型孕鼠外周母-胎免疫耐受［J］.中華婦產(chǎn)科雜志,2004（4）:234-237.

［4］武美麗，柳肅芬.反復(fù)自然流產(chǎn)的免疫學(xué)研究進(jìn)展與展望［J］.中國(guó)婦幼保健，2007，22:1707-1708.

Effects of Traditional Chinese Medicine with function of invigorating Qi and tonifying kidney on CD28 in

Abortion-Prone Mice

CHEN Xuejun,YE Ping,HULAN Yawen,et al．Taizhou Hospital of Zhejiang,Taizhou(317000),China

Abstrct Objective:To study the effects oftraditional Chinese medicine(TCM)with function ofinvigorating Qi and tonifying kidney on the expression of CD28 at spleen and maternal-fetal interface in abortion-prone mice during pregnancy. Methods:CBA female mice were mated to DBA/2 male mice to establish an abortion-prone model.The female mice were divided randomly into 4 groups(5 in each):control group(NS group):drenched normal saline everyday since the first day of gestation;western medicine(WM)group(cyclosporine group):drenched cyclosporine solution once on the 4thday of gestation;TCM group:drenched the TCM decoction with the function of invigorating Qi and tonifying kidney everyday since the first dayofgestation;and TCM-WM(TCMdecoction+cyclosporine)group:drenched the TCMdecoction everyday since the first day and cyclosporine solution on the 4thday of gestation.On the 14thday of gestation,the mice were killed in batches and their spleen and maternal-fetal interface tissues were made into single cell suspension to detect the expression of CD28 by flow cytometry (FCM).Results:The expression of CD28 in spleen tissues in NS group,cyclosporine group,TCM-WMgroup,and TCMgroup was fromhigh tolowin order and it was significantlylower in the latter 3 groups as compared with the NS group(P＜0.05).The expression ofCD28 at maternal-fetal interface in the NS,TCM, cyclosporine,and TCM-WM group was from high to low in order,with a significant difference between the TCM-WM group and the NS,TCMand cyclosporine groups(P＜0.05)and between the TCMand WMgroups and the NS group(P＜0.05).Conclusion:TCM with function of invigorating Qi and tonifying kidney may reduce the expression of CD28 in abortion-prone mice.

mice spontaneous abortion CD28 invigoratingQi and tonifyingkidney TCM

2010-08-02