ROS在腎性高血壓大鼠左室肥厚中的表達(dá)及意義

束長(zhǎng)城 魏萬(wàn)林 高進(jìn)

ROS在腎性高血壓大鼠左室肥厚中的表達(dá)及意義

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目的 研究活性氧(ROS)的表達(dá)與腎血管性高血壓(RVH)大鼠左室肥厚的關(guān)系,探討ROS在RVH大鼠左室肥厚發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法 將20只體重200g左右的雄性Wistar大鼠,隨機(jī)分為2組(n=10),建立兩腎一夾腎血管性高血壓大鼠左心室肥厚模型:對(duì)照組(SHAM)、實(shí)驗(yàn)組(2K1C),術(shù)后12周終止實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組收縮壓(SBP)、左心室重量指數(shù)(LVMI)、心臟重量指數(shù)、心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)及活性氧(ROS)水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),而抗氧化酶(SOD和GSHPX)的活性低于對(duì)照組(P＜0.01)。結(jié)論 腎血管性高血壓大鼠ROS表達(dá)增多,提示ROS參與了腎血管性高血壓左心室肥厚的形成過(guò)程。

高血壓;腎血管性;左室肥厚;活性氧

左心室肥厚(left ventricu lar hypertrophy,LVH)LVH是導(dǎo)致心肌梗死、心力衰竭、心律失常、猝死等心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。探討心肌肥厚的發(fā)病機(jī)理以及尋求有效的防治措施是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)課題。近年來(lái),左心室肥厚的病理生理研究取得重大進(jìn)展,血壓升高是常見(jiàn)的LVH重要因素外[1],氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧(ROS)與心肌肥厚的關(guān)系越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[2-4]。高血壓病引起ROS介導(dǎo)的心肌肥厚分子機(jī)制尚未明了。本實(shí)驗(yàn)擬在探討 ROS與高血壓心肌肥厚的關(guān)系,闡明高血壓致心肌肥厚的分子機(jī)制,為臨床防治心肌肥厚患者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠20只,每只體重 180～220 g,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,合格證號(hào):SCXK(京)2005-0013。

1.2 主要試劑和儀器 超氧化物岐化酶(SOD)、谷光甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)和活性氧(ROS)ELISA試劑盒(R＆D systems公司);光學(xué)顯微鏡和T00llabⅥ.Ⅱ圖像采集系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司);北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供;BP-6型無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 模型制作與分組 Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)分為2組(各10只):對(duì)照組(SHAM)、實(shí)驗(yàn)組(2K-1C)。采用經(jīng)典造模法[5]復(fù)制兩腎一夾高血壓左心室肥厚模型(two-kidney,one-clip renal hypertension model,2K 1C)。用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉,行腹正中切口,游離左腎動(dòng)脈并用內(nèi)徑為 0.25mm銀夾鉗夾,使左腎動(dòng)脈部分狹窄,右側(cè)腎動(dòng)脈不觸及。SHAM組方法相同,但不安置銀夾。術(shù)后 4周末測(cè)定尾動(dòng)脈血壓,凡尾動(dòng)脈收縮壓比術(shù)前增高2.67KPa(20mm Hg)并高于15.96KPa(120mm Hg)的大鼠,視為模型成功。

1.4 標(biāo)本的采集 大鼠普通飼料喂養(yǎng) 12周后處死,處死前12 h禁食,麻醉后稱重。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血 5m l,放入抗凝管中混勻,3500 r/m in離心10min,取上清夜-70℃保存。開(kāi)胸迅速摘下心臟,預(yù)冷的PBS(0.02mmol/l,PH 7.4)灌洗,濾紙吸干,稱重,并在 4℃下去除心房、右室游離壁、大血管和心包組織迅速分離左心室稱重(包括室間隔),計(jì)算左心室重量指數(shù) =左心室濕重/體重(g/kg)。在左室中部沿橫軸切取0.5 cm厚的心肌組織置于10%的(甲醛)中固定,石蠟切片,VG染色測(cè)定心肌膠原容積積分(CVF)。左心室剩余部分快速放入液氮中冷凍,然后分別作抗氧化酶指標(biāo)(SOD、GSH-PX)以及活性氧(ROS)的測(cè)定。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 鼠尾收縮壓測(cè)定 測(cè)定方法采用tail-cuff測(cè)壓法[6],血壓計(jì)采用BP-6型無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)。手術(shù)前、手術(shù) 4周及12周處死前各測(cè)壓 3次取其均值。

1.5.2 心肌膠原組織學(xué)測(cè)定(Van Gieson法) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,1%的酸性品紅和 5%的飽和苦味酸染色。在VG(Van Gieson)法染色下,心肌細(xì)胞呈黃色,膠原呈紅色。采用北航醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng),測(cè)量心肌組織膠原容積積分(CVF=膠原面積/總面積)。在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,以視野中所有膠原面積之和(不包括血管周圍膠原面積)除以心肌纖維和結(jié)締組織面積總和,得出CVF。

1.5.3 心肌組織中抗氧化酶(SOD、GSH-PX)和活性氧(ROS)的測(cè)定 勻漿的制備:隨機(jī)切取左心室組織(0.2～0.5 g)稱重后加入蒸餾水,在水浴中用勻漿器制備 1:10的勻漿。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)定SOD、GSH-PX及ROS的含量,試劑盒由R＆D systems公司提供,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

參加實(shí)驗(yàn)大鼠 20只,進(jìn)入結(jié)果分析的大鼠為 19只(1只實(shí)驗(yàn)中死亡),實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(SHAM)10只、實(shí)驗(yàn)組(2K 1C) 9只。

2.1 血壓變化 由表1可見(jiàn),手術(shù)前兩組大鼠收縮壓差異無(wú)顯著性(P＞0.05),術(shù)后2K 1C組大鼠收縮壓明顯高于SHAM組,差異有顯著性(P＜0.01)。

表1 兩組動(dòng)物收縮壓變化比較（±s,mm Hg)

表1 兩組動(dòng)物收縮壓變化比較（±s,mm Hg)

注:與SHAM組相比(1)P＜0.01

組別 例數(shù) 0周 4周 12周SHAM 10 105.65±4.32 109.27±5.21 119.57±6.30 2K 1C 9 105.02±3.97 151.12±9.28 174.34±14.52(1)

2.2 各組大鼠左室質(zhì)量指數(shù)和左室心肌膠原容積積分(CVF)的變化 左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)即左心室重量/體重(LVW/BW)和左室心肌膠原容積積分(CVF)是衡量左心室肥厚程度的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)。由表2可見(jiàn),腎動(dòng)脈縮窄產(chǎn)生的壓力超負(fù)荷導(dǎo)致的左室心肌肥厚,術(shù)后 12周 2K 1C組的左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)及心肌膠原容積積分(CVF)較SHAM組顯著性增加(P＜0.05)。VG染色結(jié)果顯示見(jiàn)圖1。

表2 兩組大鼠左室質(zhì)量指數(shù)及心肌膠原容積積分的變化

圖1 2組大鼠心肌膠原表達(dá)的變化(×400)

2.4 兩組大鼠左室心肌抗氧化酶和活性氧自由基的影響

由表3可見(jiàn),2K 1C組與SHAM組相比,其抗氧化酶(SOD和GSH-PX)活力水平明顯降低(P＜0.01)、ROS含量明顯提高(P＜0.01)。

表3 兩組大鼠左室心肌抗氧化酶SOD、GSH-PX以及ROS活性的變化（±s)

表3 兩組大鼠左室心肌抗氧化酶SOD、GSH-PX以及ROS活性的變化（±s)

注:與2K1C組相比(1)P＜0.01

組別 例數(shù) SOD GSH-PX ROS SHAM 10 105.12±7.20 86.51±4.24 10.20±1.38 2K 1C 9 97.58±6.26(1)80.58±6.95(1) 12.31±2.31(1)

3 討論

心肌肥厚是高血壓最常見(jiàn)的并發(fā)癥,是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?，F(xiàn)在研究普遍認(rèn)為,左室肥厚的發(fā)生發(fā)展與壓力或容量負(fù)荷過(guò)度、神經(jīng)內(nèi)分泌、細(xì)胞因子及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制激活等因素相關(guān)[7]。

活性氧 ROS屬于活性高的自由基,是生物體內(nèi)產(chǎn)生的超氧陰離子(O2-)、過(guò)氧化氫(H2O2)、羥自由基(-OH)、一氧化氮(ON)等活性含氧化合物的總稱。自由基是機(jī)體內(nèi)有機(jī)物分子的共價(jià)鍵通過(guò)均裂方式產(chǎn)生的,是具有不配對(duì)電子的原子團(tuán)、分子或離子。自由基極不穩(wěn)定,具有高度化學(xué)性,通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,攻擊蛋白質(zhì)、核酸等方式對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p傷,能破裂DNA,改變酶活性,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),影響膜功能,參與疾病的啟動(dòng)和促進(jìn)階段[8]。Byrne研究發(fā)現(xiàn)[9]ROS可作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使,在心肌肥大發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要的生理功能。當(dāng)機(jī)械壓力、AngⅡ、脂類代謝異常以及內(nèi)皮素等生理?xiàng)l件改變時(shí),均可激活 NADPH氧化酶產(chǎn)生大量ROS,導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生,進(jìn)而激活心肌肥大的發(fā)生發(fā)展[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用的二腎一夾動(dòng)物模型(2K1C)是經(jīng)典的腎性高血壓左室肥厚模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模 12周后,2K 1C組大鼠收縮壓相對(duì)處于一個(gè)穩(wěn)定期,心肌肥厚比較明顯,與對(duì)照組(SHAM組)比較,血壓、左心室重量指數(shù)LVMI及CVF明顯提高(P＜0.01),表明高血壓左室肥厚模型成功建立,與國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道一致[11,12]。2K 1C組大鼠左室心肌中 SOD和GSH-PX活力較SHAM組明顯降低、ROS水平顯著上升(P＜0.01)。說(shuō)明心肌組織的ROS水平與心肌肥厚有重要的相關(guān)性,當(dāng)心臟出現(xiàn)缺血缺氧、容量負(fù)荷增加等改變正常生理狀態(tài)的情況下,心肌細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性下降,氧自由基大量產(chǎn)生,導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)。ROS作用于心肌細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸,導(dǎo)致細(xì)胞膜流動(dòng)性、通透性和液態(tài)性發(fā)生變化,離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙,細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能造成破壞。此外,ROS能夠破壞細(xì)胞內(nèi)的溶酶體膜,使心肌細(xì)胞自溶,且影響肌漿網(wǎng)和線粒體,造成心臟能量代謝障礙,引起心肌凋亡、心臟重塑等,最終導(dǎo)致心肌肥厚。

腎性高血壓大鼠左室肥厚的形成可能與激活體內(nèi)氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量 ROS密切相關(guān)。但心肌肥厚是十分復(fù)雜的過(guò)程,還受諸多因素影響,其確切作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] RUWHOF C,VAN DER LAARSE A.Mechanical stress2induced cardiac hypertrophy:mechanismsand signal transduction pathways. Cardiovasc Res,2000,47(1):232-237.

[2] Aikawa R,Nagai T,TanakaM,et al.Reactive oxygen species in mechanical stress-induced cardiac hypertrophy.Biochem Biophys Res Commun,2001,289(4):901-902.

[3] Taniyama Y,Griendling K K.Reactive Oxygen species in the vasculature:molecular and cellular mechanisms.Hypertension,2003,42 (6):1075-1081.

[4] Zhang GX,Kimura S,Nishiyama A,etal.Cardiac oxidative stress in acute and chronic isop roterenol2infused rats.Cardiovasc Res,2005, 65(1):230.

[5] NAVAR LG,ZOU L,VON THUN A,et al.Unraveling the mystery of Goldblatt hypertension.News Physiol Sci,1998,13:170-176.

[6] 鄭敏,吳基良,李立中,尹時(shí)華,鮑翠玉.牛磺酸對(duì)腎血管性高血壓大鼠左室肥厚的保護(hù)作用.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003,19(5): 536-539.

[7] 李潞.心臟肥大發(fā)生機(jī)制研究進(jìn)展.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,11 (1):1-5.

[8] 邢瑋.心肌細(xì)胞內(nèi)ROS與高血壓性心肌肥厚關(guān)系研究.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(3):18-19.

[9] Byrne JA,Grieve D J,Cave A C,et al.Oxidative stress and heart failure.Arch Mal Coeur Vaiss,2003,96(3):214-221.

[10] Sauer H,Neukirchen W,Rahimi G,et al.Involvement of reactive oxygen species in cardiotrophin-1-induced proliferation of cardiomyocytes differentiated frommurine embryonic stem cells.Exp Cell Res,2004,294(2):313-324.

[11] NAVARL G,ZOUL,VON THUN A,et al.Unraveling,themystery of Goldblatt hypertension.News Physiol Sci,1998,13:170-176.

[12] 孫紅蕾,張敬群,馬業(yè)新.結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在腎血管性高血壓大鼠心肌中的表達(dá)及意義.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,5(20): 13-15.

The relation between ROS and left ventricular hypertrophy in the ratswith renovascular hypertension

SHU Chang-cheng,WEIWan-lin,GAO Jin.Departmentof Cardiology,General Hospitalof Beijing Military Command,Beijing,100700,China

Objective To study the relation between ROS and left ventricular hypertrophy in the rats with renovascular hypertension.Methods Twenty male wistar rats,weighing about 200g each,were random ly divided into two groups(n=10):negative control group(SHAM),operation group(2K1C),at the 12th week to stop experiment.Systolic blood pressure(SBP)wasmeasured,collagen volume fraction(CVF)was detected by Van Gieson,and SOD、GSH-PX、ROSwere detected by ELISA.Results The results showed that the SBP、LVMI、CVF and ROS in 2K1C group significantly increased(P＜0.01).compared with the SHAM group,but the activitiesof GSH-Px and SOD were decreased(P＜0.01).Conclusion Increased expression of ROS in left ventricularmyocardium of rets with renovascular hypertension indicate thatROSmay play important roles in the development of ventricular hypertrophy of RVH rats.

Hypertension;Renovascular;Left ventricular hypertrophy;Reactive Oxygen Species

100700北京軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科(束長(zhǎng)城 魏萬(wàn)林);總參第 51研究所門(mén)診部(束長(zhǎng)城);武警總醫(yī)院南樓二科(高進(jìn))

魏萬(wàn)林 Emal:wei_wanlin@126.com