HPLC法測(cè)定維生素B2片的含量

李 靜 蔡旭升 郭倩倩 龔琳琳 李秀梅

（河南三門峽市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 三門峽 472000）

維生素B2是機(jī)體中許多酶系統(tǒng)的重要輔基的組成成分，參與物質(zhì)和能量代謝。維生素B2片用于預(yù)防和治療維生素B2缺乏癥，如口角炎、唇干裂、舌炎、陰囊炎、結(jié)膜炎、脂溢性皮炎等。中國(guó)藥典2010年版二部中收載的維生素B2片含量測(cè)定方法為紫外-可見分光光度法[1]。本文對(duì)現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高，采用高效液相色譜法測(cè)定維生素B2片的含量，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于維生素B2片的含量測(cè)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津2010高效液相色譜儀；分析天平（1/10萬(wàn)，Mettler Toledo AG135）。

1.2 材料

維生素B2對(duì)照品（批號(hào)：100369-200301，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量98.7%）；維生素B2片（上海信宜黃河制藥有限公司，批號(hào)：100502、091204、101106）；甲醇、乙腈均為色譜純，庚烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑，冰醋酸為分析純，水為重蒸餾水。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 空白輔料色譜圖

圖3 供試品色譜圖

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsi C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：444nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫：30℃；在上述條件下理論塔板數(shù)為5000以上。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取維生素B2對(duì)照品約11.4mg，置500mL量瓶中，加冰醋酸5mL，水200mL，置水浴上加熱，并時(shí)時(shí)振搖使其溶解，加水適量稀釋，放冷，再用水稀釋至刻度，搖勻，即得（維生素B222.8μg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于維生素B210mg），置500mL量瓶中，加冰醋酸5mL，水200mL，置水浴上加熱，并時(shí)時(shí)振搖使其溶解，加水適量稀釋，放冷，再用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 空白輔料溶液的制備

按處方量取空白輔料適量，照樣品溶液的制備方法制備空白輔料溶液，結(jié)果表明陰性對(duì)照品不干擾測(cè)定。見圖1～3。圖1為對(duì)照品色譜圖，圖2為空白輔料色譜圖，圖3為樣品色譜圖。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取維生素B2對(duì)照品溶液（22.8μg/mL）5、10、20、30、40μL注入液相色譜儀，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，得回歸方程為Y=（5.86e-004）X+1.03e-003，r=0.9999。表明維生素B2在0.11～0.91μg之間呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液20μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定維生素B2峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD為0.25%，n=6，表明所建立方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液20μL，分別在0、2、4、6、8h測(cè)定維生素B2峰面積。結(jié)果維生素B2RSD為0.93%，n=6。表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（100502）供試品，依法平行制備6份供試品溶液，依法測(cè)定樣品中維生素B2的峰面積，并計(jì)算維生素B2的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果含量為98.7%，RSD為0.9%（n=6）表明方法重復(fù)性好。

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取維生素B2片處方量的80%，100%，120%的維生素B2對(duì)照品各3份，分別置預(yù)先按維生素B2的其他處方量的500mL量瓶中，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。低、中、高3種濃度的回收率（n=3）分別為100.2%（RSD=1.0%），99.5%（RSD=0.57%），100.5%（RSD=0.72%）；回收率平均值（n=9）為100.1%。

2.10 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的3份樣品，按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定維生素B2的含量。結(jié)果見表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討 論

3.1 維生素B2即核黃素，由核糖和異咯嗪構(gòu)成；溶于水，但溶解度低（27.5℃，12mg/100mL）；對(duì)酸穩(wěn)定，堿性條件下易分解破壞，故采取加入適量的冰醋酸，水浴加熱，以增加其在水中的溶解度；因其對(duì)光敏感，紫外線可促進(jìn)破壞，故在制備及及檢驗(yàn)過程中均應(yīng)注意避光。

3.2 參照《中國(guó)藥典》2010年版二部[1]維生素B2在444nm處有較好的吸收度。不同的流動(dòng)相甲醇-0.1mol/L乙酸銨（甲酸調(diào)PH4.5）（25∶75）[2]、乙腈-0.1mol/L乙酸銨（甲酸調(diào)pH4.5）（60∶40）、0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）[1]進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用流動(dòng)相0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）時(shí)主峰的分離度，理論塔板數(shù)，拖尾因子等參數(shù)均符合要求。對(duì)于流速的選擇方面，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流速為1.0mL/min時(shí)，泵壓力較大，故最終確定色譜條件為色譜柱：Diamonsi C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇（85∶10∶5）；流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：444nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫：30℃。

本品采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定，受輔料干擾較大；采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，檢測(cè)靈敏度高，專屬性強(qiáng)，是一種很好的測(cè)定方法。

[1]國(guó)家藥典委員編.中國(guó)藥典(二部)[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010：898.

[2]畢雪艷,趙作連,付乃華,等.HPLC法測(cè)定維鐵緩釋片中5種水溶性維生素的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(5)：389-391.