李 靜 蔡旭升 郭倩倩 龔琳琳 李秀梅
(河南三門峽市食品藥品檢驗(yàn)所,河南 三門峽 472000)
維生素B2是機(jī)體中許多酶系統(tǒng)的重要輔基的組成成分,參與物質(zhì)和能量代謝。維生素B2片用于預(yù)防和治療維生素B2缺乏癥,如口角炎、唇干裂、舌炎、陰囊炎、結(jié)膜炎、脂溢性皮炎等。中國(guó)藥典2010年版二部中收載的維生素B2片含量測(cè)定方法為紫外-可見分光光度法[1]。本文對(duì)現(xiàn)行藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提高,采用高效液相色譜法測(cè)定維生素B2片的含量,結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確可靠,重復(fù)性好,專屬性強(qiáng),可用于維生素B2片的含量測(cè)定。
島津2010高效液相色譜儀;分析天平(1/10萬(wàn),Mettler Toledo AG135)。
維生素B2對(duì)照品(批號(hào):100369-200301,購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,含量98.7%);維生素B2片(上海信宜黃河制藥有限公司,批號(hào):100502、091204、101106);甲醇、乙腈均為色譜純,庚烷磺酸鈉為高效液相色譜專用試劑,冰醋酸為分析純,水為重蒸餾水。
圖1 對(duì)照品色譜圖
圖2 空白輔料色譜圖
圖3 供試品色譜圖
色譜柱:Diamonsi C18(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5);流速:0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):444nm;進(jìn)樣量20μL;柱溫:30℃;在上述條件下理論塔板數(shù)為5000以上。
精密稱取維生素B2對(duì)照品約11.4mg,置500mL量瓶中,加冰醋酸5mL,水200mL,置水浴上加熱,并時(shí)時(shí)振搖使其溶解,加水適量稀釋,放冷,再用水稀釋至刻度,搖勻,即得(維生素B222.8μg/mL)。
取本品20片,精密稱定,研細(xì),精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于維生素B210mg),置500mL量瓶中,加冰醋酸5mL,水200mL,置水浴上加熱,并時(shí)時(shí)振搖使其溶解,加水適量稀釋,放冷,再用水稀釋至刻度,搖勻,即得。
按處方量取空白輔料適量,照樣品溶液的制備方法制備空白輔料溶液,結(jié)果表明陰性對(duì)照品不干擾測(cè)定。見圖1~3。圖1為對(duì)照品色譜圖,圖2為空白輔料色譜圖,圖3為樣品色譜圖。
精密吸取維生素B2對(duì)照品溶液(22.8μg/mL)5、10、20、30、40μL注入液相色譜儀,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線,得回歸方程為Y=(5.86e-004)X+1.03e-003,r=0.9999。表明維生素B2在0.11~0.91μg之間呈良好的線性關(guān)系。
精密吸取對(duì)照品溶液20μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,依法測(cè)定維生素B2峰面積,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果RSD為0.25%,n=6,表明所建立方法精密度良好。
取同一樣品溶液20μL,分別在0、2、4、6、8h測(cè)定維生素B2峰面積。結(jié)果維生素B2RSD為0.93%,n=6。表明樣品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。
取同一批號(hào)(100502)供試品,依法平行制備6份供試品溶液,依法測(cè)定樣品中維生素B2的峰面積,并計(jì)算維生素B2的含量和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果含量為98.7%,RSD為0.9%(n=6)表明方法重復(fù)性好。
精密稱取維生素B2片處方量的80%,100%,120%的維生素B2對(duì)照品各3份,分別置預(yù)先按維生素B2的其他處方量的500mL量瓶中,按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。低、中、高3種濃度的回收率(n=3)分別為100.2%(RSD=1.0%),99.5%(RSD=0.57%),100.5%(RSD=0.72%);回收率平均值(n=9)為100.1%。
取不同批號(hào)的3份樣品,按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定維生素B2的含量。結(jié)果見表1。
表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)
3.1 維生素B2即核黃素,由核糖和異咯嗪構(gòu)成;溶于水,但溶解度低(27.5℃,12mg/100mL);對(duì)酸穩(wěn)定,堿性條件下易分解破壞,故采取加入適量的冰醋酸,水浴加熱,以增加其在水中的溶解度;因其對(duì)光敏感,紫外線可促進(jìn)破壞,故在制備及及檢驗(yàn)過程中均應(yīng)注意避光。
3.2 參照《中國(guó)藥典》2010年版二部[1]維生素B2在444nm處有較好的吸收度。不同的流動(dòng)相甲醇-0.1mol/L乙酸銨(甲酸調(diào)PH4.5)(25∶75)[2]、乙腈-0.1mol/L乙酸銨(甲酸調(diào)pH4.5)(60∶40)、0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)[1]進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)用流動(dòng)相0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5)時(shí)主峰的分離度,理論塔板數(shù),拖尾因子等參數(shù)均符合要求。對(duì)于流速的選擇方面,通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流速為1.0mL/min時(shí),泵壓力較大,故最終確定色譜條件為色譜柱:Diamonsi C18(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:0.01mol/L庚烷磺酸鈉的0.5%冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85∶10∶5);流速:0.8mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):444nm;進(jìn)樣量20μL;柱溫:30℃。
本品采用紫外-可見分光光度法進(jìn)行含量測(cè)定,受輔料干擾較大;采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定,檢測(cè)靈敏度高,專屬性強(qiáng),是一種很好的測(cè)定方法。
[1]國(guó)家藥典委員編.中國(guó)藥典(二部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:898.
[2]畢雪艷,趙作連,付乃華,等.HPLC法測(cè)定維鐵緩釋片中5種水溶性維生素的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(5):389-391.