靈芝孢子粉對PTZ致癇大鼠神經(jīng)細胞野生型p53表達的影響①

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(1.右江民族醫(yī)學院病理生理學教研室,廣西 百色 533000 E-mail：zhsh8000@163.com;2.廣西醫(yī)科大學解剖學教研室,廣西 南寧 530021;3.佳木斯大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室,黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇(Epilepsy,EP)是一種神經(jīng)元發(fā)作性異常放電引起的、以反復癇樣發(fā)作為特征的臨床癥候群,為臨床常見慢性腦部疾患。癲癇發(fā)作可導致通過細胞凋亡實現(xiàn)的神經(jīng)細胞損傷,雖出現(xiàn)較晚,卻能持續(xù)存在,進而可以參與海馬硬化等過程[1]。而野生型p53基因(wtp53)是誘導細胞凋亡的基因之一,因此,探討wtp53基因表達變化與癲癇發(fā)病的關系及其調控機制,成為了當前癲癇發(fā)病機制研究中的課題之一。

靈芝屬珍貴的藥用真菌,其生殖細胞——靈芝孢子(粉)(ganoderma lucidum spore powder)作為靈芝的重要藥用部位逐漸為人們所認識,靈芝孢子粉是靈芝發(fā)育后期彈射釋放出的種子,生物學上稱擔孢子,集中起來呈粉末狀。靈芝孢子粉含有豐富的天然抗氧化成分、氨基酸和各種微量元素,具有免疫調節(jié)、清除自由基、提高機體攜氧能力和耐受缺氧能力等作用,可提供大腦所需能量且對神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜和保護功能[2]。然而其對癲癇防治作用尤其是對神經(jīng)細胞的保護作用研究鮮有報道。本研究旨在觀察靈芝孢子粉對戊四氮(PTZ)點燃大鼠wtp53免疫反應性的影響,進一步探討靈芝孢子粉對癲癇神經(jīng)細胞凋亡抑制作用可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性成年SD大鼠60只,10周齡,體重(200±20)g,由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物合格證編號：SCXK桂2009-0002),動物于實驗前1周置于實驗室適應環(huán)境,按照自然晝夜、普通環(huán)境飼養(yǎng),室溫(25±1)℃,自由飲食。實驗動物隨機分為空白對照組,癲癇模型組,靈芝孢子粉用藥A、B、C即高、中、低劑量 3組(分別灌胃給予靈芝孢子粉150mg/kg、300mg/kg及450mg/kg),共分為5個小組,每組12只。

1.2 藥品試劑及儀器 PTZ購自美國Sigma公司;靈芝孢子粉取自泰山靈芝孢子為棕色粉末狀物質;wtp53多克隆抗體、sABC法免疫組化檢測試劑盒、DAB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 癲癇模型的復制 PTZ用前以生理鹽水配制成溶液(10g/L),靈芝孢子粉用藥各組和癲癇模型組用PTZ亞驚厥劑量(35mg/kg)腹腔注射,每日1次,持續(xù)28天,正常對照組以等容生理鹽水代替PTZ腹腔注射。靈芝孢子粉組腹腔注射PTZ的同時再經(jīng)灌胃給予靈芝孢子粉(A組：150mg/kg;B組：300mg/kg;C組：450mg/kg),灌胃前禁食 6h,灌胃體積為10.0ml/kg,每日 1次,持續(xù)28天;癲癇模型組和空白對照組同時經(jīng)灌胃給予同體積生理鹽水。大鼠癲癇發(fā)作評分標準按Ono法[3]：0級,無任何發(fā)作反應;Ⅰ級,節(jié)律性點頭或面部抽動;Ⅱ級,陣攣性咀嚼或者點頭甩尾;Ⅲ級,頭部顫搐加前肢陣攣性抽搐;Ⅳ級,袋鼠姿勢或多肢抽動;Ⅴ級,失去平衡,跌倒;Ⅵ級,全面持續(xù)強直-陣攣發(fā)作。每天對每只鼠在PTZ注射后觀察30～60min,并記錄癲癇發(fā)作的級別。停藥1周,再用相同劑量的PTZ測試,誘發(fā)癲癇發(fā)作,凡出現(xiàn)連續(xù)5次Ⅱ級或Ⅱ級以上驚厥發(fā)作的大鼠為達到點燃標準的動物模型。

1.4 取材及wtp53免疫組織化學檢測 乙醚麻醉斷頭處死大鼠,取腦,立即分離出海馬區(qū)組織,吸去血跡,置于4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,6μ m切片備檢。石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后,用過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性,PBS沖洗后,用成套sABC免疫組織化學試劑盒檢測wtp53表達水平。一抗分別為兔抗大鼠wtp53抗體,以PBS代替一抗作陰性對照,孵育切片。具體操作步驟按sABC免疫組織化學試劑盒說明書進行。DAB顯色,蘇木素復染,脫水,透明,封片。于光鏡下觀察wtp53陽性細胞的表達情況,應用彩色病理圖文分析系統(tǒng)進行圖像分析,每張切片海馬CA1區(qū)隨機選取6個具有代表性的非重疊高倍視野,在顯微鏡下(×400)微尺計數(shù)海馬CA1區(qū)線性1mm長度的wtp53陽性細胞,并計算平均陽性細胞數(shù)。

2 結果

2.1 行為學觀察 癲癇模型組及靈芝孢子粉用藥各組大鼠在注射亞驚厥劑量PTZ后第6天開始出現(xiàn)發(fā)作反應,均有連續(xù)多次Ⅲ～Ⅵ級的癲癇發(fā)作,每次發(fā)作持續(xù)1～20min不等。上述各組實驗動物均達到點燃標準,癲癇模型復制成功。空白對照組大鼠則無異常行為改變。

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞wtp53蛋白表達結果 40×10倍光鏡下,細胞核有濃染的深棕褐色為wtp53免疫陽性細胞。癲癇模型組與空白對照組比較,wtp53免疫陽性細胞數(shù)明顯增多(P＜0.01),免疫反應增強;靈芝孢子粉高劑量用藥C組與癲癇模型組比較,wtp53免疫反應性減弱,陽性細胞數(shù)明顯減少,僅呈散在分布,差異有顯著性(P＜0.05);以PBS代替一抗的對照反應均為陰性。結果見表1。

表1 各組海馬CA1區(qū)wtp53蛋白表達水平 (±s)

表1 各組海馬CA1區(qū)wtp53蛋白表達水平 (±s)

與對照組比較,a：t=22.76,P＜0.01;與模型組比較,b：t=1.55,c：t=1.87,P 均＞0.05;d：t=5.13,P＜0.05

組別 用藥劑量(mg/kg) n wtp53陽性細胞數(shù)對照組 同體積生理鹽水 12 3.26±2.39模型組 同體積生理鹽水 12 55.72±7.62a用藥A組 150 12 51.29±6.31b用藥B組 300 12 47.33±13.52c用藥C組 450 12 38.74±8.56d

3 討論

p53基因分為野生型和突變型兩種,突變型p53(mtp53)基因是一種癌基因,可以促進癌瘤的發(fā)生發(fā)展;野生型p53基因存在于細胞內,為一種抑癌基因,一方面具有轉錄因子功能,對細胞的生長分化進行調控,同時也作為某些抑制細胞增殖基因的反式激活因子對細胞分裂進行負調控,另一方面它監(jiān)視著細胞基因的完整性,抑制細胞周期推進以及誘導細胞凋亡。有研究顯示[4],wtp53基因誘導細胞凋亡的可能機制為：降低細胞內源性Bcl-2蛋白表達并抑制其功能,Bcl-2基因作為重要的凋亡調控基因,可通過抑制線粒體膜tbid插入、Bax轉位和Bax/Bax寡聚化起到抑制細胞凋亡的作用;wtp53基因還可連接于Bax啟動子上,提高細胞中Bax的表達,使Bcl-2/Bax比例失調,從而促進細胞凋亡,因此,Bax可作為wtp53立刻早期反應基因。

另有研究表明[5],PTZ致癇后大鼠海馬CA1區(qū)wtp53蛋白大量表達出現(xiàn)的最早時間和高峰時間與原位末端標記(TUNEL)法檢測到的神經(jīng)細胞凋亡反應時序相吻合,陽性反應區(qū)域相同。大量凋亡的錐體細胞內wtp53蛋白陽性表達明顯增多[6],本實驗結果也進一步證實了wtp53基因參與了癲癇發(fā)作后海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡的過程。癲癇發(fā)作可使腦細胞內外環(huán)境發(fā)生劇烈變化,從而導致腦組織損傷。癲癇發(fā)作后神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡,wtp53基因在此過程中可起到重要的調控作用。

靈芝是一種珍貴的藥用真菌,富含靈芝多糖、多肽、有機鍺等成分,對神經(jīng)系統(tǒng)具有調節(jié)功能,可使肌肉松弛,減少動物自發(fā)活動,對抗電驚厥,有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、降低副交感神經(jīng)的興奮性等作用[7]。本實驗經(jīng)灌胃給與大鼠靈芝孢子粉后,高劑量用藥組大鼠較癲癇模型組海馬區(qū)wtp53蛋白表達明顯減少(P＜0.05),說明靈芝孢子粉對誘導癇性發(fā)作后的神經(jīng)細胞凋亡具有抑制作用,其抑制凋亡的分子機制可能是通過下調wtp53蛋白表達實現(xiàn)的,這為靈芝孢子粉作為一種治療癲癇的輔助用藥,改善腦部功能,對腦組織具有一定保護作用提供了新的依據(jù)。

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