標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE圖法測定大豆11S抗原蛋白含量的研究

石 慧 梁運(yùn)祥

標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE圖法測定大豆11S抗原蛋白含量的研究

石 慧 梁運(yùn)祥

分離純化獲得高純度的大豆11S抗原蛋白后，以100μg/ml為濃度梯度差，制備100～2000μg/ml濃度的11S抗原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用SDS-PAGE電泳法制得梯度清晰的11S抗原蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)圖。將待測定樣品SDS-PAGE電泳后，通過與標(biāo)準(zhǔn)圖比較可方便讀出樣品中11S抗原蛋白的濃度C0，并結(jié)合運(yùn)用公式W=2.15×10-5·C0×100%，可快速計(jì)算出樣品中11S抗原蛋白的含量。該測定方法具有方便、準(zhǔn)確、靈敏度高等特點(diǎn)，適合進(jìn)行大規(guī)模樣品11S抗原蛋白含量的測定。

11S抗原蛋白；SDS-PAGE；含量；測定

大豆抗原蛋白中11S抗原蛋白含量約為43.6%[1]，是大豆中主要抗原蛋白之一。作為大豆中含量最高的抗?fàn)I養(yǎng)因子及大豆的主要蛋白成分，近年來在動(dòng)物飼料的應(yīng)用上備受關(guān)注。但研究主要集中在分離純化11S抗原蛋白，分解去除抗原蛋白。除了彭楠等[2]用酶聯(lián)免疫法測定了大豆11S抗原蛋白，11S抗原蛋白的定量測定方法鮮有報(bào)道。李成賢[3]總結(jié)了大豆主要抗原蛋白的測定方法，實(shí)際上大多數(shù)是分離純化法，雖然也可以用于測定，但當(dāng)抗原蛋白含量較少時(shí)，這些方法靈敏度低，甚至不能完成測定，而且批次多時(shí)并不方便、快捷，故這些分離純化法用于測定存在很多問題。本文采用Thanh等方法[4]純化大豆11S抗原蛋白，并干燥至恒重，制成11S抗原蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)SDSPAGE圖，只要把待測樣品抗原蛋白稀釋到標(biāo)準(zhǔn)圖的濃度范圍，就可以完成11S抗原蛋白的測定，該法甚至可以檢測到含量極微的11S抗原蛋白，快捷、方便，靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及試劑

新鮮脫脂生豆粕，購自東海糧油；

蛋白質(zhì)抽提液：0.03 mol/l的Tris-HCl（含0.01 mol/l的β-巰基乙醇，pH值8.0）。

1.1.2 儀器

粉碎機(jī)，80目篩；pHS-3C pH計(jì)；CR 21G高速冷凍離心機(jī)；DYY-5電泳儀，Eppendorf微量移液器；5415R小型離心機(jī)；E2M5AZ真空冷凍干燥機(jī)；電熱鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 大豆11S抗原蛋白的分離純化

將新鮮脫脂生豆粕粉碎，過80目篩，按Thanh等（1976）的方法提純11S抗原蛋白，將上述純化的蛋白質(zhì)冷凍抽真空干燥，再在50℃電熱鼓風(fēng)烘箱中干燥至恒重，-20℃保存?zhèn)溆谩DS-PAGE檢測11S抗原蛋白的純度。

1.2.2 11S抗原蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE圖的制作

1.2.2.1 11S抗原蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

精確稱取40.00 mg干燥的11S抗原蛋白粉末，用蛋白質(zhì)抽提液配成濃度為C=2 000 μg/ml的初始溶液，再用蛋白質(zhì)抽提液將初始溶液按100 μg/ml的濃度梯度差進(jìn)行稀釋，獲得濃度100～2 000 μg/ml的11S抗原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液20個(gè)。將以上標(biāo)準(zhǔn)溶液瞬時(shí)離心混勻，取各標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl，與相同體積的加樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，冷卻后備用。

1.2.2.2 電泳

分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，上樣10 μl。電泳條件采用穩(wěn)壓方式：濃縮膠電壓47～50 V，電泳時(shí)間0.5 h；分離膠電壓125～145 V，電泳時(shí)間2.5 h。R-250染色液染色45 min，脫色液脫色至膠面無蛋白條帶處青白明晰。

1.2.3 不同來源豆粕樣品的11S抗原蛋白的檢測

粉碎待測樣品，過80目篩，50℃烘箱中將其粉末干燥至恒重，分析天平精確稱量1.000 g，用蛋白質(zhì)抽提液浸泡，料水比為1：20，搖床中160 r/min，22℃震蕩抽提1 h。8 000 r/min、22℃離心15 min，取上清液20 μl，制樣、電泳，電泳條件見 1.2.2.2 節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆11S抗原蛋白的純度檢測

圖1 提純的11S抗原蛋白SDS-PAGE圖譜

如圖1所示，泳道2清晰可見的條帶均為11S抗原蛋白的酸性亞基及堿性亞基。電泳圖表明，采用Vu Huu Thanh[4]中的方法分離純化的11S抗原蛋白的純度很高。

2.2 大豆11S抗原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)濃度SDS-PAGE圖譜

圖2 11S抗原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)濃度SDS-PAGE圖譜

2.3 11S抗原蛋白含量測定公式的建立

待測樣品中11S抗原蛋白的含量可以用以下公式計(jì)算：

式中：K——大分子抗原蛋白抽提率（%）；

C0——標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖不同泳道色帶的濃度（μg/μl）；

V0——11S標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖每個(gè)泳道的點(diǎn)樣體積（ml）；

V1——抽提未知樣品消耗的蛋白質(zhì)抽提液的總體積（μl）；

Vx——測定時(shí)點(diǎn)樣體積（μl）；

W1——待測樣品的取樣質(zhì)量（μg）；

W%——待測樣品中11S抗原蛋白的百分含量（w/w）。

11S抗原蛋白的抽提率大約為93.0%[4]（K＝93.0%），當(dāng)取樣 1.00 g（W1=1.0 ×106μg），抽提液用量20 ml（V1=2×104μl），點(diǎn)樣量為10 μl（Vx=10 μl）的條件下，公式修訂為：

2.4 不同豆粕樣品11S抗原蛋白的SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖法檢測結(jié)果

不同豆粕樣品與標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖中樣品以相同的電泳條件電泳，得到如圖3所示圖片。

比照圖2、圖3各泳道色帶與標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖中較接近的色帶及根據(jù)公式計(jì)算出的11 S抗原蛋白含量見表1。

圖3 不同豆粕樣品的SDS-PAGE圖譜

表1 SDS-PAGE法檢測不同樣品11S抗原蛋白含量

3 討論

待測樣品的色帶與標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖比照時(shí)，應(yīng)選擇待測樣品中明顯降解的酸性亞基或堿性亞基與標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖中相同的亞基比照。當(dāng)待測樣品11S抗原蛋白濃度太大，應(yīng)適當(dāng)稀釋，否則結(jié)果不準(zhǔn)確，如此次檢測的廣州樣品。

SDS-PAGE法測定11S抗原蛋白關(guān)鍵在于抗原蛋白的提取。影響本文提取方法的因素主要為：樣品的pH值、離子濃度[3]、抽提溫度及抗原蛋白是否熱變性。

①一般工廠送檢的樣品多為酸性，pH值約為3.00～7.00，而11S抗原蛋白在pH值低于8.0時(shí)，都有不同程度的沉淀[4]，抽提時(shí)很容易與渣一起被離心棄掉，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。故用蛋白抽提液浸泡樣品時(shí)應(yīng)修正樣品的pH值到8.0。

②有的樣品中添加了金屬離子或NaCl，導(dǎo)致抽提時(shí)離子強(qiáng)度增大，11S抗原蛋白發(fā)生沉淀不溶而降低抽提率[6]。需要用蛋白質(zhì)抽提液反復(fù)多次洗滌，每次洗滌將pH值調(diào)到4.5，離心。抽提時(shí)將pH值修正到8.0，保證抗原蛋白的抽提率。

③樣品中抗原蛋白的抽提如果在冬天，應(yīng)在搖床中保溫至22℃抽提，因?yàn)?1S抗原蛋白為冷不溶蛋白，低溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)不同程度的沉淀，4℃時(shí)沉淀量達(dá)到最大[3]，抽提時(shí)也很容易與渣一起被離心棄掉。

④膨化樣品或經(jīng)高溫滅菌樣品，抗原蛋白不溶于本文提到的蛋白質(zhì)抽提液。

4 結(jié)論

本文純化得到高純度的11S抗原蛋白后，以100 μg/ml的濃度梯度差，制備了 100～2 000 μg/ml濃度的11S抗原蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，并通過SDS-PAGE電泳制成了11S抗原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖。標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖的作用為通過對比待測樣品凝膠圖與標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖中相同亞基色帶的寬度和色深確定待測樣品中11S抗原蛋白的濃度。

運(yùn)用公式 W=C0·（V0V1/VxW1）/K（w/w）·100%，可計(jì)算出待測樣品中11S抗原蛋白的含量。實(shí)際上，待測樣品取樣通常為1.000 g（W1），處理后得到20 ml（V1）的抗原抽提液，抗原的抽提率K約為93.0%，待測樣品電泳上樣量通常為10 μl（Vx），標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖上樣量均為10 μl（V0），故公式修訂為W=2.15×10-5·C0×100%。從標(biāo)準(zhǔn)凝膠圖中讀出抗原蛋白的濃度后，通過該公式即可計(jì)算出11S抗原蛋白的百分含量。

[1] 郭林英，周小秋，王之盛,等.大豆球蛋白提取物對鯉魚腸上皮細(xì)胞增殖及其功能的影響[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[2] 彭楠，葛向陽，梁運(yùn)祥.酶聯(lián)免疫法測定11S大豆抗原蛋白[J].飼料研究，2006（3）：30.

[3] 李成賢，周安國，王之盛,等.大豆主要抗原蛋白的分離及測定方法的研究[J].大豆科學(xué)，2007，26（4）：618-622.

[4]Vu Huu Thanh,Kazuo Shibasaki.Major protein of soybean seeds:A straightforward sractionation and their characterization[J].J Agric.Food Chem.,1976,24（6）:1117-1121.

[5] 韓鵬飛，姜學(xué)，馬曦.大豆抗原蛋白研究進(jìn)展[J].中國畜牧業(yè)雜志，2009，45（19）：69-72.

[6] 雷繼鵬，田少君，李曉霞.分離7S和11S大豆球蛋白的簡便方法[J].糧食與油料，2003，6：6-7.

Determination of the 11S antigen content by standard SDS-PAGE figure method

Shi Hui,Liang Yunxiang

High purity of 11S antigen protein were purified from soybean meal and the standard 100～2 000 μg/ml concentration solutions with concentration gradient 100 μg/ml were prepared.Using SDS-PAGE gel electrophoresis method,a standard concentration gradient graph of 11S antigen protein were obtained.By comparing the SDS-PAGE graph of samples to the standard graph,the 11S antigen protein concentration C0of samples can be easily read,and the content of 11S antigen protein in samples could be quickly calculated according to the formula W=2.15 ×10-5·C0·100%.This method is convenient,accurate,sensitive and it's suitable for high-throughput content determination of 11S antigen protein content in samples.

11S antigen；SDS-PAGE；content；determination

S963.73+4

A

1001-991X（2011）07-0057-03

石慧，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院，講師，430205，湖北省華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院望荃樓1039室。

梁運(yùn)祥（通訊作者），華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院。

2011-02-22

（編輯：王 芳，xfang2005@163.com）