低壓缺氧對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中HIF-1α、VEGF及MMP-9表達(dá)的影響

張司蘭,譚朝陽(yáng),陳世偉,韓 威

(1.重慶市璧山縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 402760;2.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)中心 610083)

低壓缺氧對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中HIF-1α、VEGF及MMP-9表達(dá)的影響

張司蘭1,譚朝陽(yáng)1,陳世偉1,韓 威2

(1.重慶市璧山縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 402760;2.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)中心 610083)

目的觀察低壓缺氧對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達(dá)的影響。方法將日本大耳兔隨機(jī)分為常氧對(duì)照組和低壓缺氧組,高膽固醇飲食12周建立兔動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)病變模型后,取主動(dòng)脈內(nèi)膜組織分別采用免疫組織化學(xué)方法和real-time PCR檢測(cè)斑塊組織中 HIF-1α、VEGF、MMP-9蛋白和mRNA表達(dá)。結(jié)果低壓缺氧組高斑塊中HIF-1α、VEGF、MMP-9蛋白和mRNA的表達(dá)明顯升高,與常氧對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論低壓缺氧能明顯升高斑塊中 HIF-1α、VEGF、M MP-9蛋白和mRNA表達(dá),可降低兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。

動(dòng)脈粥樣硬化;缺氧誘導(dǎo)因子1,α亞基;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;基質(zhì)金屬蛋白酶-9

隨著人們物質(zhì)生活水平的提高,心血管疾病的發(fā)病率已名列各種疾病之首。據(jù)預(yù)測(cè),2020年全球范圍內(nèi)因心血管疾病造成的死亡有可能達(dá)到總死亡數(shù)的36%,從而在人類歷史上心血管疾病將首次成為第1位的致死原因[1]。其中,動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)及其并發(fā)癥是多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)和共同病理過(guò)程。特別是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂后產(chǎn)生的一系列并發(fā)癥,如心、腦血管栓塞等,嚴(yán)重威脅患者的生命安全。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶能降低AS斑塊穩(wěn)定性[2]。本研究擬探討低壓缺氧對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、VEGF及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MM P-9)表達(dá)的影響,為進(jìn)一步研究低壓缺氧與AS斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 日本大耳兔(SPF級(jí))10只[雄性,體質(zhì)量(2.0±0.2)kg]由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為 SYXK(軍)2002-029。

1.2 試劑 小鼠抗兔HIF-1α、VEGF及MM P-9一抗為美國(guó)Santa公司產(chǎn)品,山羊抗小鼠二抗、DAB試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品,TRIzol為德國(guó) Roche公司產(chǎn)品,RNasin為Takara公司產(chǎn)品,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量Real-time PCR試劑盒為上海東洋坊科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 儀器 紫外分光光度計(jì)(上海亞研公司)、MiniBISTM凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó) Labnet公司)、Light CyclerⅡ型實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增系統(tǒng)(德國(guó) Roche公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 將10只日本大耳兔隨機(jī)分為常氧對(duì)照組和低壓缺氧組。(1)常氧對(duì)照組 5只:高膽固醇飼料(含 1%膽固醇、8%豬油和7.5%蛋黃粉的粗顆粒飼料)150 g/d喂養(yǎng)12周。(2)低壓缺氧組5只:高膽固醇飼料150 g/d喂養(yǎng)12周,低壓缺氧實(shí)驗(yàn)參照Fagan[3]的方法并加以改進(jìn)。壓縮空氣與混合氣體(90%N2+10%O2)在電磁閥控制下分別以2 L/min的流速輸入低氧艙,間隔 30 s,1 min為1個(gè)循環(huán),每天 8 h,其余時(shí)間置飼養(yǎng)籠,室溫、空氣、正常攝食、水。低壓缺氧實(shí)驗(yàn)過(guò)程中艙內(nèi)混合氣體濃度由測(cè)氧儀檢測(cè),并隨機(jī)采樣送氣體成分分析。常氧對(duì)照組每日同時(shí)置相同規(guī)格有機(jī)玻璃艙內(nèi),空氣輸入,無(wú)缺氧。各組實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)日取標(biāo)本。

1.5 免疫組織化學(xué)法 主動(dòng)脈經(jīng)4%中性甲醛固定后,石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)法測(cè)定HIF-1α、VEGF和 MMP-9表達(dá)(SP法,陰性對(duì)照一抗用磷酸鹽緩沖液代替)。顯微鏡下拍照后用Image Pro Plus4.5軟件進(jìn)行圖像分析,測(cè)定陽(yáng)性物質(zhì)的表達(dá)面積和積分光密度[4]。

表1 引物序列

表2 低壓缺氧對(duì)斑塊中HIF-1α、VEGF及MM P-9 mRNA表達(dá)的影響( ±s)

表2 低壓缺氧對(duì)斑塊中HIF-1α、VEGF及MM P-9 mRNA表達(dá)的影響( ±s)

*:P＜0.05,與常氧對(duì)照組比較。

組別 HIF-1αmRNA/β-actin mRNA VEGF mRNA/β-actin mRNA M MP-9 mRNA/β-actin mRNA常氧對(duì)照組 0.026±0.004 1 0.029±0.000 5 0.096±0.018低壓缺氧組 0.038±0.005 2* 0.048±0.009 3* 0.130±0.021*

表 3 低壓缺氧對(duì)斑塊中HIF-1α、VEGF及MMP-9蛋白表達(dá)的影響( ±s)

表 3 低壓缺氧對(duì)斑塊中HIF-1α、VEGF及MMP-9蛋白表達(dá)的影響( ±s)

*:P＜0.05,與常氧對(duì)照組比較。

HIF-1α蛋白組別VEGF蛋白MMP-9蛋白表達(dá)面積(×103/μ m2) 積分光密度(×106)表達(dá)面積(×103/μ m2) 積分光密度(×106)表達(dá)面積(×103/μ m2) 積分光密度(×106)常氧對(duì)照組 9.16±1.52 16.85±2.93 25.85±4.23 12.36±3.08 49.62±7.10 58.33±6.09低壓缺氧組 12.42±2.04* 21.55±4.01* 32.59±5.49* 15.72±3.41* 61.81±8.29* 73.92±9.24*

1.6 real-time PCR檢測(cè) 從血管內(nèi)膜上刮取約30 mg粥樣組織,置于研磨缽中加入液氮研磨。勻漿移入1.5 mL EP管中,加入1 mL TRIzol,用加樣槍吹打混勻,室溫靜置 5 min。加入0.2 mL氯仿,搖勻,室溫下靜置15 min。4℃、10 000×g離心15 min,將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入等體積的異丙醇,搖勻,室溫下靜置10 min后,4℃、10 000×g離心 10 min,棄上清液,用75%乙醇清洗2次,將RNA沉淀晾干,用20 μ L無(wú)RNA酶去離子水溶解,―70℃保存待用。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng):1 μ L cDNA樣本作為PCR擴(kuò)增模板,陰性對(duì)照擴(kuò)增模板為去離子水。擴(kuò)增條件為94℃5 min,1個(gè)循環(huán);94℃30 s、72℃20 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。采用premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,見(jiàn)表 1,由上海生物工程公司合成。

2 結(jié) 果

2.1 低壓缺氧對(duì)斑塊中 HIF-1α、VEGF及MMP-9 mRNA的影響 低壓缺氧明顯升高了斑塊中 HIF-1α、VEGF及M MP-9 mRNA的表達(dá),分別為 46.15%、65.52%及45.83%(P＜0.05),見(jiàn)表 2。

2.2 低壓缺氧對(duì)斑塊中 HIF-1α、VEGF及 MMP-9蛋白表達(dá)的影響 低壓缺氧明顯升高了斑塊中 HIF-1α、VEGF及MMP-9蛋白的表達(dá)面積和積分光密度,與常氧對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),見(jiàn)表 3。

3 討 論

VEGF可由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生,正常組織中VEGF表達(dá)不明顯,其表達(dá)增加可能是機(jī)體對(duì)不同刺激的反應(yīng)受病理生理學(xué)狀態(tài)、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子等多種因素的調(diào)控[4],有多種生物學(xué)活性,如促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生、促進(jìn)多種血管活性物質(zhì)合成、促進(jìn)血管舒張、抑制血栓形成等,其中促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用具有高度特異性,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的惟一一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原。急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)主要是由不穩(wěn)定性AS斑塊破裂而繼發(fā)血栓形成所致,VEGF可能在這一過(guò)程中起重要的作用。VEGF可使AS斑塊內(nèi)膜微血管新生,新生的血管也可引起血漿滲出、斑塊內(nèi)出血和血栓形成,加速AS斑塊生長(zhǎng)、斑塊重構(gòu)及斑塊破裂[5-6],從而引起ACS的發(fā)生。

AS斑塊內(nèi)的金屬基質(zhì)蛋白酶(M MPs)主要來(lái)源于中性白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,M MPs的活性很大程度上決定了纖維帽厚度及其膠原含量,斑塊中的MMPs能有效降解纖維帽的強(qiáng)度。有研究證明,MM P-2和MMP-9在不穩(wěn)定性斑塊,特別是易發(fā)生破裂的斑塊肩部區(qū)域合成和活性明顯增加,過(guò)度分泌的MMP-2和M MP-9,通過(guò)降解纖維帽內(nèi)的膠原,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的破裂[7-8]。

HIF-1α在正常氧分壓時(shí)極不穩(wěn)定,易被泛素依賴的蛋白水解酶降解。在缺氧、癌基因的激活、抑癌基因的失活、生長(zhǎng)因子等因素的刺激作用下,細(xì)胞中的HIF-1α穩(wěn)定,使組織細(xì)胞對(duì)缺氧產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)[9-11]。HIF-1α是廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子,它可調(diào)節(jié)多種靶基因,如 VEGF、紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,Epo)等的表達(dá),其活性在維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新生血管形成,以及促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中起重要作用[12-13]。有研究表明,HIF-1α和MMP-9在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率呈正相關(guān)[14-15]。

本研究結(jié)果顯示,在低壓缺氧狀態(tài)下,兔 AS斑塊中的HIF-1α表達(dá)增加,VEGF與MM P-9的表達(dá)也增加。VEGF與MMP-9表達(dá)的增加則表明斑塊的穩(wěn)定性降低,提示在低壓缺氧狀態(tài)下,AS斑塊的穩(wěn)定性下降,其機(jī)制可能與低壓缺氧狀態(tài)下斑塊內(nèi)HIF-1α表達(dá)增加有關(guān)。

[1]Brauwald E,Shttuck.Lecture-cardiovascular medicine at the turn of the millennium triumpH,concerns and opportunities[J].N Engl J Med,1997,337(19):1360-1369.

[2]Celletti FL,Hilfiker PR,Ghafouri P,et al.Binant vascular endothelial growth factor 165 on progression of atherosclerotic plaque[J].J Am Coll Cardiol,2001,37(8):2126-2130.

[3]Fagan KA.Selected Contribution:pulmonary hypertension in mice following intermittent hypoxia[J].J Appl Physiol,2001,90(6):2502-2507.

[4]Saint Geniez M,M aharaj AS,Walshe TE,et al.Endogenous VEGF is required for visual function:evidence for a survival role on muller cells and photoreceptors[J].PLo S ONE,2008,3(11):e3554.

[5]Testa U,Pannitteri G,Condorelli GL,et al.Vascular endothelial growth factors in cardiovascular medicine[J].J Cardiovasc Med,2008,9(12):1190-1221.

[6]黃山,許健,令狐穎,等.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) VEGF在急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷中的應(yīng)用[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志,2010,18(10):1420-1422.

[7]Ii H,Hontani N,Toshida I,et al.Group IVA phospholipase A2-associated production of MMP-9 in macrophages and formation of atherosclerotic lesions[J].Biol Pharm Bull,2008,31(3):363-368.

[8]陳力量,王守力.急性冠脈綜合征患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9水平及其臨床意義[J].安徽醫(yī)學(xué),2010,31(9):1087-1090.

[9]馬雅鑾,宋劍南.缺氧誘導(dǎo)因子:一種缺氧條件下被激活的轉(zhuǎn)錄因子[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2007,15(7):528.

[10]趙吉清,吳強(qiáng),蔡穎,等.缺氧對(duì)PC12細(xì)胞 HIF-1/JAK2/NF-KB信號(hào)級(jí)聯(lián)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38(5):536-538.

[11]唐利群,周國(guó)平.低氧誘導(dǎo)因子1α對(duì)鉀-氯協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)子1啟動(dòng)子調(diào)控作用的研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26(18):3282-3284.

[12]Shui YB,Arbeit JM,Johnson RS,et al.HIF-1:an age-dependent regulator of lens cell proliferation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(11):4961-4970.

[13]曹桂明,楊梅.VEGF-C和VEGFR-3對(duì)乳腺癌淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響[J].中國(guó)腫瘤臨床,2006,33(6):310-313.

[14]張輝,黃江梅,陳艷昕,等.胃癌組織中 HIF-1α和 MMP-9的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2008,48(15):81-82.

[15]常靜,薛歆,劉愛(ài)中,等.MM P-2和 MM P-9在胃癌患者組織和血清中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(3):394-397.

Effects of periodicity hypoxia on contents of HIF-1α,VEGF and MMP-9 in rabbit atherosclerotic plaques

Zhang Silan1,Tan Zhaoyang1,Chen Shiwei1,Han Wei2
(1.Department of Cardivascular Internal Medicine,Bisan People′s Hospital of Chongqing,Chongqing 402760,China;2.Experimental Center,Department of Medical Laboratory,Chengdu Medical College,Sichun 610083,China)

ObjectiveTo observe effects of periodicity hypoxia on contents of hypoxia inducible factor-1(HIF-1α),vascular endothelial growth factor(VEGF)and matrix metalloproteinase-9(MM P-9)in atherosclerotic plaques.MethodsRabbit atherosclerotic models were set up by hypercholesterolemia diet.Contents of HIF-1α,VEGF and MMP-9 protein and mRNA in plaque were detected by immunohistochemistry and Real-time PCR methods,respectively.ResultsIn periodicity hypoxia groups,HIF-1α,VEGF and MMP-9 protein and mRNA in atherosclerotic plaques were increased markedly.ConclusionPeriodicity hypoxia could increase contents of HIF-1α,VEGF and MM P-9 protein and mRNA in rabbit atherosclerotic plaques.This maybe decreased stability of atherosclerotic plaques.

atherosclerosis;hypoxia-inducible factor 1,alpha subunit;vascular endothelial growth factor;matrix metalloproteinase-9

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.06.008

A

1671-8348(2011)06-0542-03

2010-08-25

2010-11-25)

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