介入技術制作兔大腦中動脈閉塞模型的研究

馮 雷,潘 力,馮 光,賀道華,馬廉亭

(1.南方醫(yī)科大學,廣州 510515;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經外科 430070)

介入技術制作兔大腦中動脈閉塞模型的研究

馮 雷1,2,潘 力2,馮 光2,賀道華2,馬廉亭2

(1.南方醫(yī)科大學,廣州 510515;2.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院神經外科 430070)

目的建立一種能用于影像學診斷與動脈內超選擇接觸性溶栓治療的腦梗死動物模型,并評價其技術上的可行性和穩(wěn)定性。方法將兔自體動脈血栓在數字減影血管造影(DSA)指導下經微導管注入頸內動脈,建立兔大腦中動脈栓塞模型。采用DSA觀察腦血管閉塞情況,MRI觀察腦梗死情況,改良Bederson評分法觀察神經功能缺損。24 h后處死動物,進行病理形態(tài)學檢查。結果成功建立兔大腦中動脈閉塞模型。病理及M RI檢查均發(fā)現腦組織出現梗死病灶。結論介入技術制作兔大腦中動脈閉塞模型具有創(chuàng)傷小、易存活的優(yōu)點,可用于腦梗死的早期診斷及臨床溶栓研究。

腦梗死;兔;血管造影術,數字減影;磁共振成像,彌散;模型,動物

腦血管疾病是中國人口死亡的第1位原因,其中缺血性腦卒中占75%～90%。人類缺血性腦卒中多為大腦中動脈血栓栓塞所致[1]。近年來,隨著對缺血性腦卒中病理生理過程的進一步認識,藥學及介入放射技術的發(fā)展,溶栓療法日益受到重視。因此模擬臨床疾病發(fā)病過程,建立穩(wěn)定、可靠、重復性好、價格低廉、方法簡單、發(fā)病機制類似于人類血栓栓塞性腦梗死、適用于藥物溶栓治療的模型,一直是人們普遍關注的課題。本研究用神經血管內介入技術建立了兔大腦中閉塞模型,并對其操作技術的可行性及模型的穩(wěn)定性進行分析總結,以評價其進一步在臨床上的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 新西蘭大白兔10只,雄性,體質量2.5～3.0 kg;數字減影血管造影(DSA)儀器、Signa Highspeed 1.5 T超導MRI成像儀均購自美國GE公司。

1.2 血栓制備方法 用3%戊巴比妥1 mL/kg經耳緣靜脈注射麻醉新西蘭大白兔后,碘酊消毒兔耳背面,用改良腰穿針穿刺并搔刮兔耳動脈內膜,擦傷約2 cm動脈內膜后在兔耳動脈近心端用縫合線結扎血管以減少血流,阻緩血流速度,增加栓子形成機會。24 h后再將兔麻醉,將搔刮過的兔耳動脈剪下,在放大鏡下將血管內的血栓剝出,用眼科手術刀將其切為0.5 mm×0.4 mm,置于無菌生理鹽水中待用。

1.3 模型建立方法 將麻醉后剝離耳動脈血栓的實驗兔仰臥于手術臺上,固定四肢,常規(guī)消毒,切開右股內側皮膚,分離右股動脈備插管、溶栓使用。將右股動脈遠端結扎,近心端動脈用臨時阻斷夾夾閉,用眼科剪沿45°剪開右股動脈管徑的一半,經右股動脈穿刺置入4 F導管鞘,在電視監(jiān)視與微導絲的指引下將Echelon-10微導管超選擇性插入右或左頸總動脈。導管頭端約與第2頸椎下緣水平,側位做路途,可見頸內動脈為頸總動脈向后上走行的一個分支,其起始部有一壺腹樣膨大的標志。微導管越過頸內動脈近端枕動脈開口,行正側位造影判斷血管走行情況,手推造影劑確定無明顯反流后,用1 mL注射器經微導管注入3條血栓,再次造影證實大腦中動脈閉塞后撤出微導管。閉塞后盡量保持溫度在37℃左右,分別在栓塞后2、5 h造影復查血管的再通情況。整個操作過程使用肝素生理鹽水沖洗導管。

1.4 觀察指標

1.4.1 腦血管造影 每組兔均于閉塞前、閉塞完成后及閉塞2、5 h用高壓注射器經頸內動脈置入的微導管注射對比劑碘普羅胺注射液150 mg/mL,行DSA造影檢查,觀察血管閉塞情況。

1.4.2 MRI檢查 動物模型制作成功后2、5 h立即送往MRI室行彌散加權成像(diffusion-weighted,DWI)和常規(guī)M RI檢查。DWI:單次激勵平面回波成像(EPI)序列,重復時間(TR)5 000 ms,回波時間(TE)10 ms,層厚3 mm,間隔 1 mm,視野16 cm×16 cm,矩陣128×128,掃描時間40 s。T2WI:TR 2 500 ms,TE 99 ms,層厚 3 mm,間隔1 mm,視野 24 cm ×24 cm,矩陣128×128;T1WI:TR 564 ms,TE 15 ms,層厚 3 mm,間隔1 mm,視野24 cm×24 cm,矩陣128×128。

1.4.3 神經功能缺損評分 參考Bederson的5分制法在動物麻醉清醒后24 h進行評分。0分:無神經功能缺損癥狀;1分:對側前肢屈曲;2分:拉尾時對側前肢抓力下降;3分:無方向性運動,抓尾時向對側轉圈;4分:自發(fā)向對側轉圈及意識障礙。分值越高,說明動物神經功能缺損越嚴重。

1.4.4 病理檢查 閉塞后24 h用頸動脈放血法處死動物,從延髓處完整地離斷腦組織,迅速取出大腦,在-30～-20℃冰箱中速凍20 min左右,切成6個近似5 mm厚度的冠狀切片,檢查切片有無出血,置于2%的2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)溶液中,37℃溫育30 min,然后移入10%的甲醛溶液中固定,1周后觀察腦組織的缺血范圍。求出每只兔腦梗死面積的百分比(梗死區(qū)總面積/梗死區(qū)半球總面積×100%)。取材經HE染色及石蠟包埋,光鏡下觀察病理情況。

2 結 果

2.1 神經功能缺損情況 閉塞后24 h動物均存活,可見閉塞對側肢體不同程度的偏癱,主要表現為向對側傾倒、后肢外展、無力、肌張力降低、回縮反應減弱等。10只兔中8只表現為向閉塞對側傾倒或轉圈,2只表現為閉塞對側前肢無力。

2.2 T TC染色觀察 閉塞24 h后可見閉塞側大腦中動脈分布區(qū)梗死灶明顯,肉眼下見地圖樣不規(guī)則梗死區(qū),大小為0.5～2.0 cm不等,中央呈灰白色,邊界清楚,見封3圖1。梗死灶面積百分比為(38.67±2.23)%。

2.3 光鏡檢查 閉塞對側腦神經組織HE染色,光鏡檢查均正常。閉塞側光鏡下可見梗死區(qū)腦組織水腫,神經細胞發(fā)生凝固性壞死,核固縮、消失,細胞輪廓模糊,神經細胞和膠質細胞明顯減少甚至消失,部分區(qū)域見中性粒細胞浸潤、小膠質細胞增生。梗死灶和正常區(qū)之間有明顯的分界,由內向外分別為梗死區(qū)、水腫帶及正常區(qū)。

圖2 兔正常腦血管側位DSA圖像

圖3 兔正常腦血管正位DSA圖像

2.4 DSA檢查 頸內動脈內注射自體血栓后立即行DSA檢查,發(fā)現大腦中動脈供血區(qū)不顯影或顯影減少,見圖2、3。至閉塞后2、5 h行DSA檢查,所有閉塞血管沒有出現再通,見圖4。

圖4 造模5 h后兔腦血管正位DSA圖像

2.5 磁共振檢查 10只兔缺血2 h后,T2WI、DWI均為陰性,5 h后10只兔均出現稍高或高信號改變,見圖5、6。

圖 5 造模5 h后DWI圖像

圖6 造模后5 h T2WI圖像

3 討 論

在中國每年死于腦卒中的人數超過100萬,是中國人口死因的首位,占22.45%,缺血性腦卒中約占腦卒中的80%～90%。大腦中動脈是人類缺血性腦卒中的多發(fā)部位,普遍認為大腦中動脈閉塞模型是局灶性腦缺血的標準動物模型。

常用的局灶性腦缺血動物模型與人類卒中有很大不同,不能用于溶栓及抗凝治療的研究。自體血栓閉塞法制作大腦中動脈閉塞動物模型接近人類缺血性腦卒中的病理過程,對評價溶栓或抗凝藥物的療效有一定的價值[2-7]。理想的急性大腦中動脈閉塞動物模型應符合以下要求:(1)動物的血管解剖接近人腦血管,進行腦血管造影比較容易完成,可以進行超選擇動脈內溶栓;(2)所用動物腦血管變異較少,閉塞程度和部位固定,可重復性好;(3)成功率高、手術損傷小、動物存活率高;(4)血管閉塞可以從血流變化等方面觀察到;(5)用于閉塞的血栓會自溶,但能夠被溶栓藥物溶解;(6)動物血液相對較多,可反復抽血,適合動態(tài)觀察某些生化指標的改變等[2]。豬、狗、猴和兔等大動物可在DSA下閉塞大腦中動脈,可使梗死條件的控制相對一致。靈長類動物無疑是研究腦血管疾病的最佳選擇,但倫理學和經濟上的問題都限制了該類動物的廣泛應用。豬頸內動脈與人類解剖結構差異較大,閉塞的是整個頸內動脈,梗死面積過大[8-9]。犬大腦前、中動脈供血范圍存在較大差異,并且椎動脈和基底動脈較發(fā)達,頸內動脈可通過后交通動脈竊血,使閉塞模型不易建立。兔的價格相對低廉,來源充足,能保證供給;在DSA下閉塞兔大腦中動脈,可使梗死條件的控制相對一致;兔血液相對較多,可反復抽血,適合動態(tài)觀察某些生化指標的改變;兔腦血管接近人腦血管,進行PSA比較容易完成。因此,選擇兔作為大腦中動脈閉塞的動物模型最為合適。

血栓的制備關系到造模能否成功,人類75%的腦血栓屬于富含血小板和纖維蛋白的白色血栓最為合適[10]。理想的血栓應是富含纖維素、不變形、不易自溶、大小可正好堵住大腦中動脈起始段。無論是動脈血還是靜脈血所形成的血栓都是紅色血栓,主要成分都是紅細胞和血小板,易自溶,都需進一步處理[3-4,11-13]。用改良腰穿針穿刺兔耳動脈損傷動脈內膜制備自體動脈血栓,富含纖維蛋白和血小板,與人類動脈粥樣硬化形成的血栓相似,更適合溶栓治療的研究。

以往建立模型時常用的方法是直接經頸內動脈插管注入血栓,此種方法常導致頸內動脈內膜常被損傷,易于形成血栓,影響了頸內動脈的正常血流[14]。Benes等[15]采用的方法需在顱底附近解剖頸外動脈和頸內動脈,結扎頸外動脈各分支,逆行插至頸內動脈開口處。手術暴露分叉部有難度,往往需要顯微外科手術解剖頸動脈分叉處,技術要求高、模型制作復雜、動物創(chuàng)傷大、死亡率高。另外25.7%兔的枕動脈直接從頸內動脈上分出,其中13.3%枕動脈起源于頸內動脈的遠端近顱底[16]。由于以往方法未能將頸內動脈上分出的枕動脈結扎,以致部分血栓隨血流進入枕動脈,成功率僅為50%～85%[14]。本研究進行超選擇頸內動脈插管,越過頸內動脈近端的枕動脈開口或閉塞枕動脈后再閉塞大腦中動脈,保證了成功率。本研究制備的動物模型全部成功。

經DSA發(fā)現頸內動脈為兔的顱內主要供血動脈,且顱內、外血管間沒有吻合網,腦內血管分支間的端-端吻合情況與人腦類似。枕動脈起源于頸內動脈。兔頸內動脈顱外段迂曲細長,在上升過程中形成一近似于人類虹吸部的攀。其末端發(fā)出前、后兩支,前支分出大腦中動脈和大腦前動脈后尚有部分血管供應到眼球和頭面部器官。后支是后交通動脈,其發(fā)出后向后下方走行。雙側的這兩支動脈與基底動脈形成大腦動脈環(huán),與頸外動脈之間無豐富的吻合。兔的大腦動脈環(huán)代償良好,血栓體積過大栓塞在頸內動脈近端很難形成腦梗死。本實驗中自體血栓大小0.5 mm×0.4 mm,不會直接栓塞頸內動脈。在微導管進入頸內動脈約1 cm后進行DSA觀察,如無明顯反流則注入血栓。由于大腦中動脈為頸內動脈最大分支,血流量相對較大,所以大腦中動脈閉塞的概率最高,而向后下方走行的后交通動脈閉塞的發(fā)生率最低,與人類發(fā)病率基本符合。當栓塞至右側大腦中動脈M1段近端時則主要表現為大腦半球和基底節(jié)梗死,當栓塞至M1遠端時則主要表現為小葉皮層梗死,當栓塞至大腦中動脈M2段遠端時則主要表現為局灶性腦梗死。由于目前的介入器械尚無法超選擇插管到兔大腦中動脈注入栓子,所以部分血栓有時可進入大腦前動脈或對側顱內動脈。

DSA可精確顯示血栓閉塞部位及血栓溶解、動脈再通的情況,但不能顯示腦實質異常及梗死范圍。通過DWI來判斷缺血范圍,不僅可判斷溶栓治療的療效,而且可用于缺血半暗帶的研究。本研究閉塞24 h后處死動物行 TTC染色亦證明了大腦中動脈供血區(qū)的梗死,位置及范圍與DSA檢查相符。

本研究結果顯示,介入技術制作兔大腦中動脈閉塞模型更接近人類缺血性腦卒中的病理過程,具有不需開顱、創(chuàng)傷小、缺血效果可靠、動物存活率高的優(yōu)點,尤其適合選擇性動脈內溶栓治療的研究。白色血栓符合人類腦血栓的特點,穩(wěn)定性好。該模型穩(wěn)定,重復性好,可進一步推廣應用于腦梗死的影像學診斷、病理生理變化等研究。

[1]Kudo M,Aoyama A,Ichimori S,et al.An animal model of cerebral infarction homologous blood clot rats[J].Stroke,1982,13(4):505-508.

[2]胡頂高,吳宣富,余力.兔局灶性腦梗死溶栓動物模型的建立[J].第一軍醫(yī)大學學報,2000,20(4):324-326.

[3]鄭永玲,胡長林.大鼠大腦中動脈血栓栓塞腦缺血模型的實驗研究[J].神經損傷與功能重建,2009,1(4):25-27.

[4]劉增品,劉懷軍.犬腦缺血模型的建立及動脈內溶栓的研究[J].河北醫(yī)科大學學報,2007,28(2):105-110.

[5]Zhang Z,Zhang RL,Jiang Q,et al.A new rat model of the thrombotic focal cerebralischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,1997,17(2):123-135.

[6]Kashiwabara S,Kurokawa Y,UedeT,et al.Direct continuous observation of in situ thrombolysis in the cerebral embolic model of rabbits[J].No To Shinkei,1998,50(4):347-354.

[7]Overgaard K,Sereghy T,Pedersen H,et al.Neuroprotection with NBQX and thrombolysis with rt-PA in rat embolic stroke[J].Neurol Res,1993,15(5):334-339.

[8]秦智勇,陳銜城,張福林.豬急性腦栓塞動物模型[J].上海醫(yī)科大學學報,1998,25(5):374-376.

[9]秦智勇,陳銜城,馬端,等.不同劑量重組葡激酶治療幼豬急性腦梗死對凝血和纖溶功能的影響[J].中國急救醫(yī)學,2002,22(1):4-6.

[10]Victor J,Marder B,Dennis J.et al.Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke[J].Stroke,2006,37:2086-2093.

[11]Overgaard K,Sereghy T,Pedersen H,et al.Effect of delayed thrombolysis with rt-PA in a rat embolic stroke model[J].J Cereb Blood Flow Metab,1994,14:472-477.[12]Lapchak PA.Effect of internal artery reperfusion in combination with tenecteplase on clinical scores and hemorrhagc in a rabbit embolic storke model[J].Brain Res,2009,1294:211-217.

[13]Busch E,Krǜger K,Hossmann KA.Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat[J].Brain Research,1997,778:16-24.

[14]Hamilton MG,Lee JS,Cuming PG,et al.A comparison of intra-arterial and intravenous tissue-type plasminogen activator on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J].Stroke,1994,25:651-656.

[15]Benes V,Zabramski JM,Boston M,et al.Effect of intraarterial tissue plasminoger activator and urokinase on autologous arterial emboli in the cerebral circulation of rabbits[J].Stroke,1990,21(11):1594-1599.

[16]Lee JS,Hamilton MG,Zzbraski JM,et al.Variations in the anatomy of the rabbit cervical carotid artery[J].Stroke,1994,25:501-503.

Embolism model of middle cerebral artery in rabbits with interventional technique

Feng Lei1,2,Pan Li2,Feng Guang2,He Daohua2,Ma Lianting2
(1.Southern Medical University,Guangzhou 510515,China;2,Wuhan General Hospitalof Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China)

ObjectiveTo establish a artery occlusion animal model for the study of imaging diagnosis and superselective intra-arterial contacting thrombolytic treatment,and to evaluate the technique feasibility and stability.MethodsFocal cerebral infarction was produced by embolizing the artertial cerebri media with arterial emboli by means of digital subtraction angiography.DSA and MRI were uesd to observe the cerebral vascular obstruction and infarction,the modified Bederson scoring was used to observe the neurologic impairment.Animals were sacrificed and the cerebrum was taken out for pathology after 24 h.ResultsAll the artery occlusion animal model were successful established,the animals survived after embolization.The cerebral infarctions were found in the cerebrum of animals.ConclusionThe model of acute cerebral infarction in rabbits with interventional embolism is simple,microinvasive and reliable.It can be used for early diagnosis of cerebral infarction and clinical thrombolysis study.

brain infarction;rabbits;angiography,digital subtraction;diffusion magnetic resonance imaging;models,animal

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.06.005

A

1671-8348(2011)06-0535-03

2010-08-09

2010-11-22)

·經驗交流·