蛋白酶體抑制劑MG132抑制體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大的實(shí)驗(yàn)研究

朱靜雯,陳保林,馬躍東,劉 晨,4

(貴州省人民醫(yī)院:1.干醫(yī)科;2.心內(nèi)科,貴陽(yáng) 550002;中山大學(xué):3.附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部;4.衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510080)

蛋白酶體抑制劑MG132抑制體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大的實(shí)驗(yàn)研究

朱靜雯1,陳保林2△,馬躍東3,劉 晨3,4

(貴州省人民醫(yī)院:1.干醫(yī)科;2.心內(nèi)科,貴陽(yáng) 550002;中山大學(xué):3.附屬第一醫(yī)院心血管醫(yī)學(xué)部;4.衛(wèi)生部輔助循環(huán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510080)

目的研究蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響。方法采用[3H]-亮氨酸參入率測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝,采用IPP 6.0圖像分析軟件分析心肌細(xì)胞表面積,以及用 RT-PCR檢測(cè)β-肌球蛋白重鏈(β-M HC)表達(dá)。結(jié)果MG132預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率增加(P＜0.01)、表面積增大(P＜0.01)和β-MHC mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論MG132能夠抑制心肌細(xì)胞肥大,具有心肌保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞;肥大;蛋白酶體;β-肌球蛋白重鏈

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)機(jī)械張力以及各種刺激的重塑反應(yīng),然而持續(xù)的肥厚顯著增加惡性心律失常、心源性猝死和心力衰竭發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[1]。蛋白酶體是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中具有蛋白水解作用的大分子復(fù)合物,催化細(xì)胞內(nèi)大約80%的蛋白質(zhì)降解,對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起了重要作用[2-3]。以往的研究表明,蛋白酶體功能異常與一些心血管疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血-再灌注損傷、心功能衰竭,以及家族肥厚性心肌病等的發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)。近年來(lái)有報(bào)道顯示,特異性蛋白酶體抑制劑MG132(Z-Leu-Leu-Leu-aldehyde)通過(guò)抑制蛋白酶體活性能夠抑制細(xì)胞增生,并具有抗炎、抗凋亡[4]、抗腫瘤等活性[4-5]。蛋白酶體抑制劑已成為抗腫瘤藥物治療的研究熱點(diǎn),但其在心肌細(xì)胞肥大中的作用尚不明確。本研究通過(guò)苯腎上腺素(PE)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞肥大,旨在觀察MG132對(duì)心室重構(gòu)的可能保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 出生1～3 d的SD大鼠(清潔級(jí)),由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。DMEM/F12培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司,Brdu購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,MG132購(gòu)于美國(guó)Alexis公司,蛋白酶體活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega公司,[3H]-亮氨酸由北京原子能研究所提供,隨機(jī)引物、dNTP、M-MLV、PCR mix購(gòu)于 TaKaRa公司,T rizol購(gòu)于Invitrogen公司,PCR引物由Invitrogen公司合成。

1.2 原代心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) 無(wú)菌條件下開(kāi)胸取出完整心臟,浸于 D-Hank′s液中,沖去血污。在超凈臺(tái)內(nèi),去除心底結(jié)締組織和心房,剪開(kāi)心室,將心室心肌組織剪碎成1 mm3大小,以0.05%Ⅰ型膠原酶消化,37℃恒溫槽輕輕振蕩2 h,之后以5倍于組織碎塊體積的0.125%胰酶消化2～3次,每次5 min,直至不見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)塊。收集細(xì)胞懸液至含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中,以200目篩網(wǎng)過(guò)濾后接種至培養(yǎng)瓶,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)60 min,用差時(shí)貼壁法去除成纖維細(xì)胞。心肌細(xì)胞以5×105/mL的密度接種于6孔板,加0.1 mmol/L 5-BrdU以抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng),加入青霉素及鏈霉素各100 U/mL防止細(xì)菌污染。培養(yǎng)48 h后細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片,并出現(xiàn)同步收縮,換成無(wú)血清的培養(yǎng)基,饑餓24 h后進(jìn)行分組干預(yù)。

1.3 蛋白酶體活性檢測(cè) 加入 MG132(0.1、1.0、10.0 μ mol/L)干預(yù)6 h,提取蛋白并定量,按蛋白酶體活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū) 操作,取 10 μ g 樣品和 10 μ L 的 Suv-Leu-Leu-Val-Try-AMC,再加入反應(yīng)緩沖液使反應(yīng)體系為 100 μ L,37℃下孵育30 min,熒光分光光度計(jì)(波長(zhǎng)380 nm)測(cè)量吸光度值。然后根據(jù)對(duì)蛋白酶體活性抑制的效果選擇合適的MG132劑量用于對(duì)心肌肥大的進(jìn)一步研究。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 分為對(duì)照組、1 μ mol/L MG132組(MG 組)、10 μ mol/L 苯腎上腺素組(PE 組)、10 μ mol/L 苯腎上腺素(PE)+1 μ mol/L MG132組(MG+PE組)。MG132于 PE刺激前30 min干預(yù)。

1.5 [3H]-亮氨酸參入率測(cè)定心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成 細(xì)胞分組干預(yù)后同時(shí)將終濃度為 1 μ Ci/mL的[3H]-亮氨酸加入細(xì)胞中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞裂解液并轉(zhuǎn)移至閃爍瓶中,加入閃爍液,用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(CPM),以CPM/106cell表示[3H]-亮氨酸參入率。以對(duì)照組細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率作 100%,各組[3H]-亮氨酸參入率以百分率表示。

1.6 心肌細(xì)胞的表面積測(cè)定 細(xì)胞干預(yù)48 h后以IPP 6.0圖像處理系統(tǒng)攝像,各組隨機(jī)選取4次實(shí)驗(yàn)的邊界清晰的細(xì)胞,測(cè)量100個(gè)細(xì)胞的表面積,以IPP 6.0圖像分析軟件分析結(jié)果。

1.7 心肌細(xì)胞β-肌球蛋白重鏈(β-M HC)mRNA 表達(dá)的測(cè)定用Trizol試劑提取細(xì)胞總 RNA,取 1 μ g RNA為模板。按照 RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。β-M HC引物:上游 5′-CAA CAC CAA CCT GTC CAA GTT C-3′,下 游 5′-TGC AAA GGC TCC AGG TCT GAG G-3′,擴(kuò)增片段大小為 204 bp;βactin 引物:上游 5′-GGA AAT CGT GCG TGA C-3′,下 游 5′-GGA AGG TGG ACA GTG AG-3′,擴(kuò)增片段大小為 440 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min,95℃變性45 s,55℃退火40 s,72℃延伸 1 min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳,用Image J軟件進(jìn)行分析,結(jié)果以各目的條帶的灰度值與相應(yīng)內(nèi)參β-actin灰度比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 MG132對(duì)心肌細(xì)胞蛋白酶體活性影響 同劑量MG132(0.1、1.0、10.0 μ mol/L)呈濃度依賴(lài)性的抑制蛋白酶體活性,以10 μ mol/L濃度對(duì)蛋白酶體活性抑制最明顯(P＜0.01)。提示MG132能夠有效抑制體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的蛋白酶體活性。

圖1 各組心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率比較

2.2 MG132對(duì)苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率增加的影響 各組心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率見(jiàn)圖1,MG132對(duì)正常心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率無(wú)影響,與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PE組[3H]-亮氨酸參入率明顯增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而MG132預(yù)處理能明顯抑制PE所引起的心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率增加,MG+PE組與PE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 MG132對(duì)苯腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大的影響 各組心肌細(xì)胞表面積見(jiàn)圖2,MG132不影響正常心肌細(xì)胞表面積,與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PE組心肌細(xì)胞表面積增大,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而MG132預(yù)處理能明顯抑制苯腎上腺素所引起的心肌細(xì)胞表面積增大,MG+PE組與PE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2 各組心肌細(xì)胞表面積比較

2.4 心肌細(xì)胞β-M HC mRNA表達(dá)的測(cè)定 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3,MG132對(duì)正常心肌細(xì)胞β-M HC mRNA表達(dá)無(wú)影響,與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。PE刺激心肌細(xì)胞后β-MHC mRNA表達(dá)增加,PE組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。MG132能明顯抑制苯腎上腺素誘導(dǎo)的β-MHC mRNA表達(dá),MG+PE組與PE組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 RT-PCR檢測(cè)β-MHC mRNA表達(dá)結(jié)果

3 討 論

心肌肥大是高血壓、心瓣膜病等心血管疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥,是心腦血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。當(dāng)前的臨床藥物治療對(duì)改善心肌肥大有一定的作用,但效果并不理想。蛋白酶體是一種具有多種蛋白水解功能的大分子復(fù)合物,在泛素-蛋白酶體通路介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解中起催化作用。蛋白酶體沉降系數(shù)為26 S,稱(chēng)為26 S蛋白酶體,由一個(gè)20 S亞單位及2個(gè)19 S亞單位組成[3]。蛋白酶體不僅通過(guò)降解清除損傷的和錯(cuò)誤折疊的細(xì)胞蛋白質(zhì),還通過(guò)影響一些特殊功能蛋白和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期增殖、凋亡、免疫應(yīng)答以及基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[6-8],對(duì)維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定乃至整個(gè)生物體的正常功能發(fā)揮起了重要的作用。隨著研究的深入,蛋白酶體已成為一個(gè)藥物開(kāi)發(fā)研究的理想靶點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注。蛋白酶體包含多種蛋白酶活性,主要有糜蛋白酶活性、胰蛋白酶活性以及后谷氨酰肽水解酶活性等[9]。糜蛋白酶活性最常被用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞和組織中的蛋白酶體活性,并且糜蛋白酶作用底物被認(rèn)為是最具蛋白酶作用特異性的。Depre等[10]在壓力過(guò)負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥厚模型中發(fā)現(xiàn),肥大心肌細(xì)胞糜蛋白酶樣蛋白酶體活性是正常對(duì)照組的兩倍,認(rèn)為蛋白酶體活性增高參與了心肌細(xì)胞肥大的形成。近年來(lái)的研究表明,蛋白酶體抑制劑通過(guò)抑制蛋白酶體活性,能夠影響細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和信號(hào)分子的表達(dá),進(jìn)而干擾細(xì)胞增殖、分化、凋亡過(guò)程[11-13]。MG132是最早被發(fā)現(xiàn)和廣泛應(yīng)用的醛肽類(lèi)蛋白酶體抑制劑,能直接作用于20 S蛋白酶體的活性位點(diǎn)發(fā)揮生物學(xué)作用,具有較高的活性和選擇性[5,9],在心肌細(xì)胞中能抑制多種蛋白酶體亞型的活性而不影響細(xì)胞正常的生物學(xué)功能[8-9]。盡管研究已經(jīng)顯示MG132對(duì)心肌細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激[14]、抗動(dòng)脈粥樣硬化、預(yù)防動(dòng)脈再狹窄[11],以及能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞多種熱休克蛋白表達(dá)提供心肌保護(hù)作用[14-15],但其對(duì)心肌肥大的作用仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)MG132預(yù)處理能夠有效抑制糜蛋白酶樣蛋白酶體活性,在本研究使用的劑量范圍內(nèi)呈一定程度的濃度依賴(lài)性,而更大劑量的MG132則有可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性[16]。本研究進(jìn)一步應(yīng)用PE刺激原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞,構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型,并觀察蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。在細(xì)胞水平,心肌細(xì)胞肥大表現(xiàn)為細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、體積增大和胚胎基因再表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,MG132對(duì)正常心肌細(xì)胞[3H]-亮氨酸參入率、表面積以及胚胎基因β-MHC mRNA表達(dá)量無(wú)影響,但可明顯抑制PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、表面積增大和β-MHC mRNA表達(dá)增加,提示蛋白酶體可能參與心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生、發(fā)展。正常情況下,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)處于一個(gè)持續(xù)降解和再合成的動(dòng)態(tài)過(guò)程,細(xì)胞內(nèi)促肥大因子與肥大抑制因子間的相互作用決定了細(xì)胞是否向著肥大方向發(fā)展[17]。有報(bào)道表明蛋白酶體活性增加能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞中肥大抑制因子的降解[10],使得促肥大因子相對(duì)占優(yōu)勢(shì),導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。因此,MG132有可能通過(guò)抑制蛋白酶體活性從而調(diào)控心肌細(xì)胞肥大信號(hào)通路發(fā)揮抑制心肌肥大作用,其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。

總之,蛋白酶體抑制劑MG132能夠有效抑制PE介導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,為心肌肥大的治療提供了新思路。然而,需要進(jìn)一步在體的實(shí)驗(yàn)研究評(píng)價(jià)其對(duì)心肌細(xì)胞長(zhǎng)期作用的有效性、安全性,以及最佳劑量。

[1]邱紅梅.S2亞硝基谷胱甘肽對(duì)PGF2α誘導(dǎo)心肌肥大的抑制作用[J].重慶醫(yī)學(xué),2009,38,(18):2304.

[2]Mitch WE,Goldberg AL.Mechanisms of muscle wasting.The role of the ubiquitin-proteasome pathway[J].N Engl J Med,1996,335(25):1897.

[3]Willis MS,Patterson C.Into the heart:the emerging role of theubiquitin-proteasomesystem[J].J Mol Cell Cardiol,2006,41(4):567.

[4]Nalepa G,Rolfe M,Harper JW.Drug discovery in the ubiquitin-proteasome system[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(7):596.

[5]He Q,Huang Y,Sheikh MS.Proteasome inhibitor MG132 upregulates death receptor 5 and cooperates with ApO2L/TRAIL to induce apoptosis in Bax-proficient and-deficient cells[J].Oncogene,2004,23(14):2554.

[6]馬紅艷,肖斌,鐘?；?等.高糖對(duì)腎小球系膜細(xì)胞Smurf 2表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2010,39,(1):10.

[7]Ciechanover A.Intracellular protein degradation:from a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting[J].Cell Death Differ,2005,12(9):1178.

[8]Kloss A,Meiners S,Ludwig A,et al.Multiple cardiac proteasome subtypes differ in their susceptibility to proteasome inhibitors[J].Cardiovasc Res,2010,85(2):367.

[9]Alexandrova A,Petrov L,Georgieva A,et al.Effects of proteasome inhibitor,MG132,on proteasome activity and oxidative status of rat liver[J].Cell Biochem Funct,2008,26(3):392.

[10]Depre C,Wang Q,Yan L,et al.Activation of the cardiac proteasome during pressure overload promotes ventricular hypertrophy[J].Circulation,2006,114(17):1821.

[11]Meiners S,Laule M,Rother W,et al.Ubiquitin-proteasome pathway as a new target for the prevention of restenosis[J].Circulation,2002,105(4):483.

[12]Zolk O,Schenke C,Sarikas A.The ubiquitin-proteasome system:focus on the heart[J].Cardiovasc Res,2006,70(3):410.

[13]Liu L,Yang C,Herzog C,et al.Proteasome inhibitors prevent cisplatin-induced mitochondrial release of apoptosis-inducing factorand markedlyameliorate cisplatin nephrotoxicity[J].Biochem Pharmacol,2010,79(2):137.

[14]Dreger H,Westphal K,Weller A,et al.Nrf2-dependent upregulation of antioxidative enzymes:a novel pathway for proteasome inhibitor-mediated cardioprotection[J].Cardiovasc Res,2009,83(2):354.

[15]Luss H,Schmitz W,Neumann J.A proteasome inhibitor confers cardioprotection[J].Cardiovasc Res,2002,54(1):140.

[16]Dong X,Liu J,Zheng H,et al.In situ dynamically monitoring the proteolytic function of the ubiquitin-proteasome system in cultured cardiac myocyte[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004,287(3):1417.

[17]Razeghi P,Taegtmeyer H.Cardiac remodeling:UPS lost in transit[J].Circ Res,2005,97(10):964.

Proteasome inhibitor MG132 attenuate cardiomyocyte hypertrophy in vitro

Zhu Jingwen1,Chen Baolin2△,Ma Yuedong3,Liu Chen3,4
(1.Department of Geriatrics;2.Department of Cardiology,the People′s Hospital of Guizhou Province,Guiyang,Guizhou 550002,China;3.Department of Cardiology,the First Af filiated Hospital;4.Key Laboratory on Assisted Circalation of Ministry of Health,Sun Yat-Sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,China)

ObjectiveTo investigate the effects of proteasome inhibitor MG132 on cardiomyocyte hypertrophy in vitro.MethodsCardiomyocyte protein synthesize was determined by measuring the[3H]-Leucine incorporation rate.With the aid of IPP 6.0 Image software,the surface areas of cardiomyocytes was analyzed.The mRNA expression of fetal gene β-myosin heavy chains(β-MHC)was measured by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).ResultsMG132 significantly inhibited phenylephrine(PE)induced increase in cardiomyocyte[3H]-Leucine incorporation rate(P ＜0.01),surface area(P ＜0.01)and β-M HC mRNA expression(P＜0.05).ConclusionMG132 may inhibite cardiomyocyte hypertrophy,and demonstrate an cardioprotective activity.

cardiomyocyte;hypertrophy;proteasome;β-myosin heary chains

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.06.004

A

1671-8348(2011)06-0532-03

△通訊作者,Tel:13890458227;E-mail:chenbl104@126.com。

2010-06-07

2010-10-01)

·經(jīng)驗(yàn)交流·