APE1單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系的研究*

李 崢,李夢俠,廖 玲,王 東

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心,重慶 400042)

APE1單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系的研究*

李 崢,李夢俠,廖 玲,王 東△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所腫瘤中心,重慶 400042)

目的探討中國重慶漢族人群脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(APE1)基因單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系。方法采用病例對照研究,應(yīng)用相對的兩對引物-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-CTPP)技術(shù)檢測455例肺癌患者和443例健康人APE1―141T/G和APE1 148Asp/Glu單核苷酸多態(tài)性(SNP)。結(jié)果APE1―141G/G基因型相對于T/T基因型,顯著減少了患肺癌的風(fēng)險(OR=0.62;95%CI為0.42～0.91);單倍體分析中,APE1―141T/148Glu單倍體相對于―141T/148Asp單倍體,顯著增加了患肺癌的風(fēng)險(OR=1.28,95%CI為1.01～1.62)。結(jié)論APE1基因與中國重慶漢族人群肺癌易感性密切相關(guān),APE1―141T/148Glu單倍體可能是肺癌的重要遺傳易感因素。

肺腫瘤;脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶 1;單核苷酸多態(tài)性

肺癌是中國最常見的惡性腫瘤,也是病死率最高的惡性腫瘤之一,其患病率和發(fā)病率隨著環(huán)境污染及吸煙率的上升在世界上大多數(shù)國家逐年上升[1]。據(jù)統(tǒng)計,肺癌在中國城市腫瘤死亡順序中已由第4位上升為第1位。肺癌的發(fā)生與環(huán)境、遺傳等諸多因素有關(guān),其中吸煙是最重要的環(huán)境危險因素。然而,同處于吸煙環(huán)境的個體并不都患肺癌,這一事實表明,個體是否患肺癌并非單純?nèi)Q于環(huán)境因素,在很大程度上還取決于個體的遺傳易感性[2]。

堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)是DNA修復(fù)系統(tǒng)中最主要的一種修復(fù)途徑,在修復(fù)DNA損傷、維持DNA完整性中起著不容忽視的作用,其關(guān)鍵的限速酶為脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)。APE1基因具有DNA修復(fù)和氧化還原雙重功能,其在多種腫瘤組織和細(xì)胞株中均呈過表達(dá),APE1基因功能的異常與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。APE1基因中存在多個單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點,某些位點的突變可能改變APE1的功能,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的dbSNP數(shù)據(jù)庫中報道的APE1基因中存在的SNP有近20個,多數(shù)位于內(nèi)含子,其最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)大于5%的SNP只有兩個,分別是位于啟動子區(qū)的APE1―141T/G(rs1760944)和位于外顯子5的APE1 148Asp/Glu(T1394G,rs1130409)。目前國內(nèi)外研究較多的是APE1 148Asp/Glu,大多數(shù)研究報道其與肺癌易感性不相關(guān),最近也有APE1―141T/G與肺癌易感性的研究報道[4-5],但這兩個多態(tài)性位點聯(lián)合作用于肺癌易感性方面的研究還未見報道。因此本研究通過病例對照研究的方法,分析在中國重慶漢族人群中APE1―141T/G、APE1 148Asp/Glu的SNP及其聯(lián)合作用與肺癌易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組病例對照研究包括455例肺癌患者和443名健康人,所有入選者均為重慶地區(qū)漢族人群。病例組選取2007年1月至2008年12月在本院經(jīng)病理學(xué)診斷確診為肺癌的患者,共455例,無年齡、性別、癌癥家族史和臨床分期的限制。排除標(biāo)準(zhǔn)包括曾經(jīng)患有其他癌癥病史以及未知的放、化療病史者。入選患者幾乎占到同一時期本院診斷為肺癌患者的95%。對照組隨機(jī)選取同一時期、同一社區(qū)的健康體檢者443例,并按年齡、性別與病例組頻數(shù)配對。此研究經(jīng)大坪醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),并且所有研究對象均簽署知情同意書。本研究通過調(diào)查問卷形式完成了對每個人的信息收集。問卷內(nèi)容包括人口學(xué)特征(如年齡、性別、癌癥家族史)、生活方式(如吸煙支數(shù))和藥物治療史等。吸煙每天超過1支,并持續(xù)1年以上或者戒煙少于1年者定義為吸煙者;每天吸煙少于1支、且短于1年者定義為非吸煙者。戒煙超過1年者定義為曾經(jīng)吸煙者。

表1 引物序列和產(chǎn)物長度

1.2 樣本采集 抽取外周靜脈血3 mL,經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝,于―80℃冰箱保存,常規(guī)酚-氯仿抽提法獲得外周血白細(xì)胞DNA。

1.3 基因分型 采用相對的兩對引物-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction with confronting two-pair primers,PCR-CTPP)檢測APE1的兩個多態(tài)性位點APE1―141T/G(rs1760944)以及 APE1 148Asp/Glu(T/G,rs1130409)。本研究針對每條等位基因設(shè)計了相應(yīng)的引物對和產(chǎn)物長度,見表1,等位基因最終通過產(chǎn)物長度來識別。PCR反應(yīng)體系為25 μ L。 其中模板 DNA 2 μ L,40×Taq-DNA 聚合酶 0.5 μ L,上、下游引物各12.5 pmol,MgCl21.5 mM,5×PCR緩沖液5 μ L,dNTPs 0.30 mM。PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min后,95℃變性1 min,58℃(APE1― 141T/G)或 60℃(APE1 148Asp/Glu)退火1 min,72℃延伸1 min,共30個循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型。之后隨機(jī)選擇5%樣本進(jìn)行DNA測序,測序得到的基因型與采用PCR-CTPP技術(shù)得到的基因型完全相同,見圖1、2。

圖1 APE1―141T/G瓊脂糖電泳及測序結(jié)果

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。以χ2檢驗比較各基因型在病例組與對照組之間的差異,

并應(yīng)用多元logistic回歸模型計算相對風(fēng)險度的比值比(OR)及其95%可信區(qū)間(95%CI),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。APE1單倍體重建采用phase軟件2.1版。

圖2 APE1 148Asp/Glu(T/G)瓊脂糖電泳及測序結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1 病例組與對照組一般情況的比較 本實驗入選對象共898人,見表2,病例組和對照組在性別、年齡、吸煙狀態(tài)及癌癥家族史等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)檢驗對照組基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律,表明該樣本具有群體代表性。

表2 肺癌組及對照組一般情況的比較[n(%)]

2.2 基因型及等位基因分布頻率與肺癌患病風(fēng)險的相關(guān)性病例組與對照組APE1基因型及等位基因分布頻率見表3。APE1―141G/G相對于T/T基因型,顯著減少了患肺癌的風(fēng)險(OR=0.62;95%CI,0.42～0.91;P=0.02)。進(jìn)一步 logistic回歸分析結(jié)果顯示,在 APE1―141位點,等位基因G相對于等位基因T,顯著降低了患肺癌的風(fēng)險(OR=0.81;95%CI,0.67～0.98;P=0.03)。與攜帶 APE1 148Asp/Asp基因型相比,攜帶APE1 148Glu/Glu基因型的個體并不顯著增加患肺癌的風(fēng)險(OR=1.28;95%CI,0.86～1.91;P＞0.05),見表 3、4。

表3 APE1―141T/G基因型及等位基因分布頻率與肺癌患病風(fēng)險的關(guān)系

表4 APE1 148Asp/Glu基因型及等位基因分布頻率與肺癌患病風(fēng)險的關(guān)系

表5 APE1單倍體與肺癌易感性的關(guān)系

2.3 APE1單倍體與肺癌患病風(fēng)險的相關(guān)性 為進(jìn)一步闡明APE1基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系,本研究用APE1―141T/G和 APE1 148Asp/Glu兩個多態(tài)性位點構(gòu)建了4個APE1單倍體,見表5。在這些單倍體中,與最常見的APE1―141T/148Asp單倍體相比,APE1―141T/148Glu單倍體顯著增加了患肺癌的風(fēng)險(OR=1.28,95%CI為1.01～1.62,P=0.04)。

3 討 論

肺癌是目前中國最常見的惡性腫瘤之一,而且其發(fā)病率有逐年增加的趨勢,嚴(yán)重影響人類的健康,然而其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前較一致的觀點認(rèn)為,肺癌的發(fā)生是環(huán)境危險因素和個體遺傳因素共同作用的結(jié)果?；蚨鄳B(tài)性是決定疾病易感性、表型和治療反應(yīng)性差異的重要因素,在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本文通過病例對照研究,對APE1基因單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系進(jìn)行了探討。

APE1基因,全長2.6 kb,編碼318個氨基酸(相對分子質(zhì)量約為37 kD)。APE1基因是DNA堿基切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵限速酶,是細(xì)胞DNA烷化劑和氧化劑損傷的重要修復(fù)因子[6];此外,APE1還能通過氧化還原依賴和非依賴途徑,行使氧化還原功能,調(diào)節(jié)許多轉(zhuǎn)錄因子,包括p53、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、核因子-κ B(NF-kB)等,以及雙鏈復(fù)合蛋白(PAX-8)等的DNA結(jié)合活性以及相應(yīng)的特異性目標(biāo)基因表達(dá),參與細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞周期及凋亡調(diào)控等重要作用[7]。

本研究發(fā)現(xiàn) APE1―141G/G基因型相對于T/T基因型,顯著減少了患肺癌的風(fēng)險(OR=0.62;95%CI,0.42～0.91;P=0.02)。Lo等[4]與 Lu等[5]在2009年發(fā)表的文章中也得出了相同的結(jié)論。APE1―141T/G位于基因啟動子區(qū),通常認(rèn)為啟動子區(qū)的SNP位點可改變啟動子活性,從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,并通過基因表達(dá)量的變化而影響其功能。Lo等[4]與Lu等[5]在APE1―141T/G減少患肺癌風(fēng)險的進(jìn)一步研究中,卻得出了關(guān)于APE1―141G/G基因型影響APE1轉(zhuǎn)錄活性的不同結(jié)論。Lo等[4]認(rèn)為―141G/G導(dǎo)致APE1轉(zhuǎn)錄活性增加,從而增加了APE1的修復(fù)能力。這一觀點似乎合理,因為APE1在堿基切除修復(fù)途徑中發(fā)揮核心作用,主要修復(fù)與人類癌癥風(fēng)險相關(guān)的大量細(xì)胞毒素和突變引起的堿基損傷[8]。APE1修復(fù)能力增加,將修復(fù)更多的受損堿基,以確保細(xì)胞的完整性,使患肺癌的風(fēng)險減少。而Lu等[5]則認(rèn)為―141G/G導(dǎo)致APE1轉(zhuǎn)錄活性降低,從而降低了APE1的修復(fù)能力。這一觀點的理由是若當(dāng)DNA損傷范圍較廣,超過了細(xì)胞的自我修復(fù)能力,通過凋亡來清除受損細(xì)胞,相對于不完善的DNA修復(fù)將是更好的選擇[9]。因此他們認(rèn)為,對于無法修復(fù)的DNA損傷,DNA修復(fù)基因的高表達(dá)反而會抑制細(xì)胞凋亡,使缺陷細(xì)胞增加,進(jìn)而增加患癌癥的風(fēng)險。所以APE1轉(zhuǎn)錄活性的降低,降低了 APE1修復(fù)能力,增加了細(xì)胞凋亡,從而使患癌癥的風(fēng)險減少。以上兩個實驗結(jié)果不同的原因可能是雙方選擇不同肺癌細(xì)胞株造成的。然而關(guān)于APE1基因的功能改變與肺癌易感性的關(guān)系,還有待于進(jìn)一步研究。

APE1 148Asp/Glu單核苷酸多態(tài)性由堿基T突變成堿基G,可導(dǎo)致單個氨基酸的替換(Asp突變成Glu)[10],其與肺癌易感性的關(guān)系已被廣泛研究,但結(jié)果卻不一致[11-15]。迄今為止報道的APE1 148Asp/Glu與患肺癌風(fēng)險關(guān)系的流行病學(xué)研究中,僅在日本的吸煙者與不吸煙者中有顯著的相關(guān)性[13]。而其他大多數(shù)的研究中,兩者沒有顯著相關(guān)性[14-15]。本研究也表明APE1 148Asp/Glu與肺癌易感性無顯著相關(guān)。

對于遺傳易感因素來說,每個多態(tài)性位點的存在對于疾病的發(fā)生與發(fā)展并不只是起到一個孤立的作用,其相互之間亦存在一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)與作用,單倍體則是這種遺傳關(guān)聯(lián)的體現(xiàn),所以對于單倍體的研究更易于揭示多個SNP與疾病易感性的關(guān)聯(lián)[16]。在本研究中,兩個多態(tài)性位點共構(gòu)建了4種單倍體。其中相對于―141T/148Asp單倍體,―141T/148Glu單倍體顯著增加了患肺癌的風(fēng)險(OR=1.28,95%CI,1.01～1.62,P=0.04),表明―141位點為 T時,148位點由Asp突變到Glu,將導(dǎo)致―141T/148Glu單倍體患肺癌風(fēng)險增加,可能表明APE1 148Asp/Glu增加患肺癌的易感性。本研究結(jié)果同時提示APE1單倍體型―141T/148Glu對于中國重慶漢族人群肺癌的發(fā)生可能是重要的遺傳易感因素,而關(guān)于這兩個位點單倍體型與APE1基因功能的關(guān)系尚值得進(jìn)一步研究。

本研究對APE1―141T/G、148Asp/Glu SNP位點與肺癌易感性的關(guān)系進(jìn)行了初步分析,研究結(jié)果證明,APE1基因與中國重慶漢族人群的肺癌具有相關(guān)性。攜帶 APE1―141G/G基因型的個體相對于攜帶APE1―141T/T的個體,明顯減少患肺癌的風(fēng)險。APE1―141T/148Glu單倍體可能是肺癌的重要遺傳易感因素。但是由于SNP在肺癌易感性方面的低外顯率,不能確定是由單一SNP本身還是與此SNP在同一單倍體上的其他未知位點共同決定或參與了肺癌的易感性,要解決這一問題,還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加對APE1基因的其他SNP檢測,并結(jié)合功能研究來驗證APE1基因?qū)Ψ伟┑淖饔谩?/p>

[1]Kurzepa-Hasan E,Hasan K,Adamek R.Tobacco smoking among population in the United Kingdom of Great Britain and Northern Ireland between years:1950 and 2003[J].Przegl Lek,2008,65(10):740-741.

[2]Andersson U,McKean-Cowdin R,Hjalmars U,et al.Genetic variants in association studies--review of strengths and weaknesses in study design and current knowledge of impact on cancer risk[J].Acta Oncol,2009,48(7):948-954.

[3]Tudek B.Base excision repair modulation as a risk factor for human cancers[J].Mol Aspects Med,2007,28(3-4):258-275.

[4]Lo YL,Jou YS,Hsiao CF,et al.A polymorphism in the APE1 gene promoter is associated with lung cancer risk[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(1):223-229.

[5]Lu J,Zhang S,Chen D,et al.Functional characterization of a promoter polymorphism in APE1/Ref-1 that contributes to reduced lung cancersusceptibility[J].FASEB J,2009,23(10):3459-3469.

[6]Demple B,Sung JS.Molecular and biological roles of Ape1 protein in mammalian base excision repair[J].DNA Repair,2005,4(12):1442-1449.

[7]Tell G,Damante G,Caldwell D,et al.The intracellular location of APE1/Ref-1:more than a passive phenomenon[J].Antioxidants and Redox Signaling,2005,7(3):367-384.

[8]Hung RJ,Hall J,Brennan P,et al.Genetic polymorphisms in the base excision repair pathway and cancer risk:a HuGE review[J].Am J Epidemiol,2005,162:925-942.

[9]El-Domyati M,Attia S,Saleh F,et al.Proliferation,DNA repair andapoptosis in androgenetic alopecia[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2009,23(1):7-12.

[10]Xi T,Jones IM,Mohrenweiser HW.Many amino acid substitution variants identified in DNA repair genes during human population screenings are predicted to impact protein function[J].Genomics,2004,83:970-979.

[11]Hung RJ,Brennan P,Canzian F,et al.Large-scale investigation of base excision repair genetic polymorphisms and lung cancer risk in a multicenter study[J].J Natl Cancer Inst,2005,97:567-576.

[12]Kiyohara C,Takayama K,Nakanishi Y.Association of genetic polymorphisms in the base excision repair pathway with lung cancer risk:a meta-analysis[J].Lung Cancer,2006,54:267-283.

[13]Ito H,Matsuo K,Hamajima N,et al.Gene-environment interactions between the smoking habit and polymorphisms in the DNA repair genes,APE1 Asp148Glu and XRCC1 Arg399Gln,in Japanese lung cancer risk[J].Carcinogenesis,2004,25:1395-1401.

[14]Shen M,Berndt SI,Rothman N,et al.Polymorphisms in the DNA base excision repair genes APEX1 and XRCC1 and lung cancer risk in Xuan Wei,China[J].Anticancer Res,2005,25:537-542.

[15]Ryk C,Kumar R,Thirumaran RK,et al.Polymorphisms in the DNA repair genes XRCC1,APEX1,XRCC3 and NBS1,and the risk for lung cancer in never-and eversmokers[J].Lung Cancer,2006,54:285-292.

[16]Kim KJ,Lee HJ,Park M H,et al.SNP identification,linkage disequilibrium,and haplotype analysis for a 200-kb genomic region in a Korean population[J].Genomics,2006,88:535-540.

Association of single nucleotide polymorphism of APE1 gene with susceptibility to lung cancer*

Li Zheng,Li Mengxia,Liao Ling,Wang Dong△
(Cancer Center,Daping Hospital and Research Institute of Surgery,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)

ObjectiveTo explore the genetic association between the single nucleotide polymorphism(SNP)of APE1 gene and the susceptibility to lung cancer among Chinese Han people in Chongqing.MethodsA population based case control study was conducted in 443 healthy controls and 445 lung cancer patients.The SNP of APE1―141T/G and APE1148Asp/Glu were detected by polymerase chain reaction with confronting two-pair primers(PCR-CTPP).ResultsFor the APE1―141T/G polymorphism,individuals with G/G genotype significantly decreased the risk of developing lung cancer compared with those harboring T/T genotype(OR=0.62;95%CI,0.42―0.91)and APE1―141T/148Glu haplotype markedly increased the risk,compared to―141T/148Asp haplotype(OR=1.28;95%CI:1.01―1.62),according to haplotype analysis.ConclusionThis study confirms the close relationship between APE1 gene and Lung cancer.APE1―141T/148Glu haplotype may serves as an important genetic susceptibility factor for lung cancer.

lung neoplasm;apurinic/apyrimidinic endonuclease 1;single nucleotide polymorphism

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.06.003

A

1671-8348(2011)06-0528-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(30670628)。△< class="emphasis_bold">通訊作者,

,Tel:(023)68757151;E-mail:dongwang64@hotmail.com。

2010-05-09

2010-09-22)

·臨床研究·