HPLC法測(cè)定清開靈顆粒中黃芩苷的含量*

劉國榮 房紹英 李炳龍 李 珂 周延萌 辛?xí)悦?/p>

(1.蒼山縣人民醫(yī)院藥劑科，山東，臨沂 277700; 2.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東，泰安 271016)

清開靈顆粒由膽酸、豬去氧膽酸、黃芩提取物、梔子、水牛角、金銀花、板藍(lán)根和珍珠母等中藥組成，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神功效。用于外感風(fēng)熱所致發(fā)熱、煩躁不安、咽喉腫痛及上呼吸道感染等[1]。

黃芩苷(baicalin, C21H18O11)是清開靈顆粒的主要有效成分之一，可作為該制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道用HPLC外標(biāo)法測(cè)定清開靈顆粒中主要成分的含量[2]。為提高制劑質(zhì)量控制方法的穩(wěn)定性和可靠性，本實(shí)驗(yàn)建立了以內(nèi)標(biāo)法測(cè)定清開靈顆粒中黃芩苷含量的高效液相色譜法，用于清開靈顆粒中黃芩苷含量測(cè)定效果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

LC-10AT高效液相色譜儀(島津儀器蘇州有限公司)；SPD紫外可見檢測(cè)器(島津儀器蘇州有限公司)；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)；R-20G2電子分析天平；DP-01真空壓力泵；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料和試劑

黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品(山東省諸城市浩天藥業(yè)，批號(hào)：H20073931)；丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110708-200505)；清開靈顆粒(黑龍江省遠(yuǎn)達(dá)藥業(yè)集團(tuán)哈爾濱一洲制藥有限公司，批號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z10930010)；甲醇(色譜純)；重蒸餾水；磷酸。

1.3 藥品配制

1.3.1內(nèi)標(biāo)物丹皮酚儲(chǔ)備液的配制

精密稱取丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品0.0049 g，置于100 ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，得內(nèi)標(biāo)物丹皮酚的儲(chǔ)備液(49 ug/ml)。

1.3.2黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品0.0030 g，置于25 ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容度，得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(120 ug/ml)。

1.3.3黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密量取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(120 ug/ml)0.25、 0.5、1.0、2.0和4.0 ml，分別置于25 ml容量瓶中，各加入內(nèi)標(biāo)丹皮酚儲(chǔ)備液1.0 ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為1.2、2.4、4.8、 9.6和19.2 ug/ml黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.4樣品溶液的配制

取清開靈顆粒適量，研細(xì)，精密稱取1.5 g，置100 ml容量瓶中，加流動(dòng)相溶解，超聲處理30 min，放冷，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1.0 ml置于10 ml容量瓶中，加入0.4 ml內(nèi)標(biāo)丹皮酚儲(chǔ)備液，稀釋至刻度，搖勻，得樣品溶液。

2 方法與結(jié)果

2.1 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相甲醇與0.2%磷酸(V∶V)組成分別為40∶60、48∶52、55∶45的條件下，分別取黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液20 ul進(jìn)樣，記錄色譜圖。

結(jié)果當(dāng)甲醇與0.2%磷酸組成為40∶60時(shí)，黃芩苷保留時(shí)間為18.89 min，耗時(shí)較長；甲醇與0.2%磷酸組成為48∶52時(shí)，黃芩苷與內(nèi)標(biāo)丹皮酚不能有效分離；甲醇與0.2%磷酸組成為55∶45時(shí)，黃芩苷和內(nèi)標(biāo)丹皮酚的保留時(shí)間分別為5.5 min和9.4 min，分離良好，故選擇甲醇與0.2%磷酸組成為55∶45作流動(dòng)相。

2.2 色譜條件

色譜柱為Lichrospher C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.2%磷酸(55∶45)為流動(dòng)相，流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長為278 nm；柱溫為室溫。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1系統(tǒng)適用性

取濃度為4.8 μg/ml黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl進(jìn)樣，記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果黃芩苷和內(nèi)標(biāo)物丹皮酚的保留時(shí)間(tR)分別為5.4 min和9.3 min，二者的分離度R=2.26(R>1.5)。，以黃芩苷色譜峰計(jì)算，理論塔板數(shù)(N)為3995求。

圖1 黃芩苷與內(nèi)標(biāo)物丹皮酚的色譜圖

2.3.2定量限和檢測(cè)限

按照黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液制備方法，依次制備更低濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，取20 ul進(jìn)樣。當(dāng)濃度為1×10-2ug/ml時(shí)，S/N=10；當(dāng)濃度為4.5×10-3ug/ml時(shí)，S/N=3。

2.3.3線性關(guān)系

分別取系列濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μl進(jìn)樣，各濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄色譜圖。以黃芩苷色譜峰面積(Ai)與內(nèi)標(biāo)物丹皮酚色譜峰面積(A)的比值(Y)為縱坐標(biāo)，黃芩苷濃度(C)為橫坐標(biāo)作圖，得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。黃芩苷在1.2～19.2 ug/ml范圍內(nèi)，與色譜圖峰面積比呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.1453C-0.1425，相關(guān)系數(shù)r=0.9975。

圖2 黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4精密度

分別取高、中、低三個(gè)濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)溶液20 ul進(jìn)樣，各重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算黃芩苷與內(nèi)標(biāo)物丹皮酚的色譜圖峰面積比值。結(jié)果三種不同濃度色譜圖峰面積比值的RSD分別為1.23%，0.33%，1.00%。

2.3.5重復(fù)性

精密稱取清開靈顆粒5份，按照樣品溶液的制備方法處理，取20 ul進(jìn)樣，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣三次，記錄色譜圖。結(jié)果5份樣品峰面積比的RSD值為0.62%。

2.3.6穩(wěn)定性

按照樣品溶液的制備方法新鮮制備清開靈樣品溶液，分別在放置0、2、4、6、8、10h時(shí)進(jìn)樣20 ul，測(cè)定黃芩苷與內(nèi)標(biāo)物丹皮酚的峰面積比。結(jié)果樣品放置10 h，其黃芩苷含量基本穩(wěn)定，RSD值為0.96%。結(jié)果見表1。

表1 黃芩苷穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.7加樣回收率

取已知黃芩苷含量的樣品溶液3份，分別精密加入高、中、低3個(gè)濃度的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，測(cè)定含量并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 黃芩苷在清開靈顆粒中的加樣回收率

2.4 樣品含量測(cè)定

取清開靈顆粒，按照樣品溶液的制備方法，平行制備3份樣品，取20 ul進(jìn)樣，記錄色譜圖，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芩苷含量，結(jié)果見表3。

表3 清開靈顆粒中的黃芩苷含量

3 討 論

黃芩苷是中藥黃芩和清開靈顆粒中的主要有效成分之一，為黃酮類化合物。測(cè)定黃芩苷的含量，是控制黃芩藥材質(zhì)量及其多種制劑質(zhì)量的重要技術(shù)手段，已被廣泛用作相關(guān)制劑質(zhì)量控制的主要指標(biāo)[4-6]。

本文以丹皮酚為內(nèi)標(biāo)物，建立了內(nèi)標(biāo)法測(cè)定清開靈顆粒中黃芩苷含量的高效液相色譜法。該法具有操作簡便快速、專一性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定等特點(diǎn)。可以用于評(píng)價(jià)黃芩藥材質(zhì)量和各種含有黃芩苷的制劑及其復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

[1] 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第十一冊(cè)[S].1996:21.

[2] 韓杰.HPLC測(cè)定清開靈顆粒中黃芩苷、梔子苷及膽酸、豬去氧膽酸的含量[J].中成藥，2010,32(2):227-231.

[3] 文敏,李雪,付守廷.黃芩苷藥理作用研究新進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,25(2):158.

[4] 王洪杰，馮宇飛，劉佩莉.HPLC法測(cè)定生物樣品中雙黃連有效成分黃芩苷的含量[J].黑龍江中醫(yī)藥,2008,3(1):52-53.

[5] 劉平，王艷君.HPLC法測(cè)定開光復(fù)明片中黃芩苷的含量[J].中國藥房,2007,18(27):2130-2131.

[6] 李運(yùn)景,陳鈞茂,張錦興，等.HPLC測(cè)定清肺合劑中黃芩苷的含量[J].藥品評(píng)價(jià),2007,4(4):313-314.