外環(huán)境樣本中產(chǎn)毒型O1群霍亂弧菌雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測(cè)方法的建立＊

黃世旺,徐丹戈,徐昌平,張 政,方葉珍,包芳珍,李 劍,蔣雪鳳,盧亦愚

霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是引起烈性腸道傳染病霍亂的病原菌,其傳統(tǒng)檢測(cè)多以細(xì)菌培養(yǎng)法為主,操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來(lái),人們逐漸將PCR、熒光定量PCR技術(shù)引入到霍亂弧菌的快速檢測(cè)中[1-4],這對(duì)霍亂疫情的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療起到了積極的作用。但PCR檢測(cè)需要開(kāi)蓋電泳易受污染造成假陽(yáng)性的發(fā)生,使其在應(yīng)用上受到了一定限制;而目前在熒光定量PCR診斷方面大多停留在單重?zé)晒鈾z測(cè)階段[4]或是僅應(yīng)用于臨床前研究。我們?cè)?006年建立熒光定量PCR快速檢測(cè)霍亂弧菌方法[5]的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步深入研究,建立了雙重?zé)晒舛縋CR快速檢測(cè)O1群霍亂弧菌技術(shù),并采集352件外環(huán)境樣本對(duì)建立的雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了臨床驗(yàn)證,取得了滿意的效果,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與臨床樣本 O1群霍亂弧菌(小川型)、O139群霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌由浙江省疾病預(yù)防控制中心與省內(nèi)相關(guān)疾控中心提供。

外環(huán)境監(jiān)測(cè)樣本:2008年杭州市某區(qū)4-11月份采集的352件外環(huán)境樣本。

1.2 引物與探針 從 GenBank上分別下載rfbO1和CT基因序列,進(jìn)行同源性比對(duì)后,在rfbO1基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和 Taqman探針,探針5′端標(biāo)記HEX熒光報(bào)告基團(tuán),在CT基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和 Taqman探針,探針 5′端標(biāo)記ROX熒光報(bào)告基團(tuán)。引物和探針均委托 TA KARA公司合成,序列見(jiàn)表1。

表1 霍亂弧菌CT基因、rfbO1基因引物和探針序列Table 1 Sequences of primers and probe for rfb-O1 and CT gene ofVibrio cholerae

1.3 菌種培養(yǎng)和模板DNA提取 無(wú)菌條件下將各種菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中,36℃培養(yǎng)過(guò)夜復(fù)蘇;劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,36℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜;挑取單菌落重新接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯,增菌6h,用“煮沸法”提取核酸:即取1mL上述增菌液加入1.5mL離心管中,4 000r/min離心 6min富集,去上清,加入 100μL DEPC水重懸,煮沸 10min,10 000r/min離心 2 min,吸取上清液作為模板DNA,-80℃保存?zhèn)溆谩?.4 病原菌的定量標(biāo)準(zhǔn) 純培養(yǎng)增菌6h,取一份菌液,煮沸 10min后測(cè) OD492nm值,調(diào)節(jié)濃度使OD492nm=0.1(相當(dāng)于 1.0 ×107cfu/mL)[6],依次作10倍稀釋,備用。另取一份菌液調(diào)至相同濃度,進(jìn)行10倍稀釋并涂布,每個(gè)稀釋度涂布3塊平板,進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。

1.5 單重、雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 單重、雙重?zé)晒舛縋CR均采用 Ta KaRa公司的 Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)試劑盒,在Mx3000P型熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。在單重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,雙重?zé)晒舛縋CR采用的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表2。

1.6 雙重?zé)晒舛縋CR的特異性、敏感性和重復(fù)性 提取O1群霍亂弧菌、O139群弧菌弧菌、創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、沙門(mén)菌、志賀菌等核酸,用建立的雙重?zé)晒舛縋CR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證體系的特異性。同時(shí)對(duì)已定量的O1群霍亂弧菌標(biāo)準(zhǔn)株稀釋后分別提取DNA,平行進(jìn)行單重與雙重?zé)晒舛?PCR,比較其敏感性,并構(gòu)件標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證體系穩(wěn)定性。

表2 雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件Table 2 The reaction conditions of the multiplex real-time quantitative PCR method

1.7 結(jié)果判定方法 霍亂弧菌rfbO1、CT基因分別用HEX和ROX熒光信號(hào)來(lái)標(biāo)記。當(dāng)rfbO1陽(yáng)性、CT陽(yáng)性時(shí),鑒定為產(chǎn)毒型O1群霍亂弧菌;當(dāng)rfbO1陽(yáng)性、CT陰性時(shí),鑒定為非產(chǎn)毒型O1群霍亂弧菌;當(dāng)rfbO1陰性、CT陽(yáng)性時(shí),鑒定為產(chǎn)毒型非O1群霍亂弧菌。

檢測(cè)結(jié)果以Ct值<37并且擴(kuò)增曲線呈S型為陽(yáng)性判定原則,其中Ct值<35且擴(kuò)增曲線良好可直接判定為陽(yáng)性,Ct值在35～37之間需重復(fù)實(shí)驗(yàn),兩次實(shí)驗(yàn)均能得到良好S型擴(kuò)增曲線方可判定為陽(yáng)性。

1.8 外環(huán)境樣本中標(biāo)本核酸制備

1.8.1 外環(huán)境樣本的采集和處理

1.8.1.1 海水產(chǎn)品(除甲魚(yú)外) 取腮部和腸內(nèi)容物或貝殼內(nèi)軟組織25g,剪碎后加入225mL堿性蛋白胨水中37℃增菌6h(突發(fā)疫情時(shí)先增菌1h,挑取部分上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),其余繼續(xù)增菌至6h)后,挑取以上樣本的上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng);同時(shí)取2-3滴轉(zhuǎn)種于10mL堿性蛋白胨水中作第二次增菌,37℃增菌6h后再進(jìn)行熒光定量 PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)。

1.8.1.2 甲魚(yú) 用5-6支無(wú)菌棉簽反復(fù)涂抹活甲魚(yú)體表(特別是泄殖腔、腳趾及其周?chē)欛尢?,轉(zhuǎn)入100 mL堿性蛋白胨水中37℃增菌6h后(突發(fā)疫情時(shí)先增菌1h,挑取部分上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),其余繼續(xù)增菌至6h),挑取以上樣本的上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng);同時(shí)取2～3滴轉(zhuǎn)種于10mL堿性蛋白胨水中作第2次增菌,37℃增菌6h后再進(jìn)行熒光定量 PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)。

1.8.1.3 外環(huán)境水樣 用滅菌廣口瓶采集500mL,取450 mL加入10倍堿性蛋白陳水50 mL,37℃增菌過(guò)夜后(突發(fā)疫情時(shí)先增菌1h,挑取部分上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),其余繼續(xù)增菌過(guò)夜),挑取以上樣本的上層增菌液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng);同時(shí)取2～3滴轉(zhuǎn)種于10mL堿性蛋白胨水中作第2次增菌,37℃增菌6h后再進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)和傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)。1.8.2 外環(huán)境樣本DNA提取 將增菌后的堿性胨水混勻,吸取10mL至15mL離心管中,1 000r/min離心10min,吸取1mL上層液體經(jīng)4 000r/min離心10min,收集沉淀,加 100μL DEPC水重懸,煮沸10min,10 000r/min離心,取上清,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié) 果

2.1 雙重?zé)晒舛縋CR的特異性 對(duì)O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌、空腸彎曲菌、副溶血性弧菌、甲型副傷寒沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、福氏志賀菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別提取核酸,采用霍亂弧菌TaqMan雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),除O1群霍亂弧菌顯示CT、rfbO1基因均陽(yáng)性,O139群霍亂弧菌顯示CT基因陽(yáng)性外,其它所有細(xì)菌的檢測(cè)結(jié)果均陰性。說(shuō)明該體系具有高度特異性。

2.2 雙重?zé)晒舛縋CR的檢測(cè)靈敏度 O1群霍亂弧菌定量后(OD492nm=0.1,相當(dāng)于1.0×107cfu/mL)[6],將其稀釋至 1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101cfu/mL,提取細(xì)菌DNA,平行進(jìn)行單重?zé)晒舛?PCR與雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng),比較其靈敏度。結(jié)果雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)O1群霍亂弧菌rfbO1基因、CT基因檢測(cè)靈敏度均達(dá)到了1.0×102cfu/mL,與單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)rfbO1基因、CT基因靈敏度相當(dāng)。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 雙重、單重?zé)晒舛?PCR檢測(cè)O1群霍亂弧菌rfbO1基因靈敏度比較注:曲線A和B,C和D,E和 F,G和 H,I和J分別表示雙重和單重?zé)晒舛?PCR方法檢測(cè)相同濃度O1群霍亂弧菌 rfbO1基因,核酸濃度依次為 106、105、104、103、102cfu/mL,101cfu/mL與陰性對(duì)照均未出峰Fig.1 Sensitivity for detection of rfb-O1 gene for Vibrio cholerae serogroup O1 with multiplex real-time PCR and real-time PCR.Note:106-102cfu/mL from left to right and 101cfu/mL is negative.

圖2 雙重、單重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)O1群霍亂弧菌CT基因靈敏度比較注:曲線A和B,C和D,E和 F,G和 H,I和J分別表示雙重和單重?zé)晒舛?PCR方法檢測(cè)相同濃度O1群霍亂弧菌CT基因,核酸濃度依次為106、105、104、103、102cfu/mL,101cfu/mL與陰性對(duì)照均未出峰Fig.2 Sensitivity for detection of CTgene forVibrio cholerae serogroup O1 with multiplex real-time PCR and realtime PCR.Note:106-102cfu/mL from left to right and 101cfu/mL is negative.

2.3 雙重?zé)晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以已知霍亂弧菌濃度為橫坐標(biāo),以PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo),可以得到細(xì)菌相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。rfbO1基因、CT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.998,提示雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)檢測(cè)體系檢測(cè)不同濃度的細(xì)菌核酸均具有理想的效果。

圖3 雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)O1群霍亂弧菌rfbO1基因、CT基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of the CTand rfb-O1 gene for Vibrio cholerae serogroup O1 detected by the multiplex realtime PCR

2.4 雙重?zé)晒舛縋CR應(yīng)用于外環(huán)境樣本監(jiān)測(cè)中我們利用建立的雙重?zé)晒舛?PCR檢測(cè)方法對(duì)2008年4-11月份所采集的352件外環(huán)境樣本進(jìn)行了檢測(cè),同時(shí)與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行比較,共檢測(cè)出5株帶毒力基因的O1群霍亂弧菌。如表3和圖4所示。

表3 2008年4-11月采集352份外環(huán)境樣本中檢出5株O1群霍亂弧菌情況Table 3 Five strains of toxigenic Vibrio cholerae serogroup O1 were collected from 352 environmental specimens from Apr.to Nov.2008

利用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè),5份陽(yáng)性標(biāo)本中只有1份在1次、2次增菌中均分離到O1群霍亂弧菌,其余4份均只在2次增菌中分離到,這可能與監(jiān)測(cè)樣本本身含菌量少有關(guān)。而我們利用所建立的雙重?zé)晒舛縋CR法進(jìn)行檢測(cè),這5份標(biāo)本均在1次、2次增菌中同時(shí)檢測(cè)出霍亂弧菌,這就在很大程度上避免了漏檢,有效防止假陰性結(jié)果的發(fā)生。

3 結(jié) 論

圖4 雙重?zé)晒舛縋CR對(duì)部分外環(huán)境樣本中O1群霍亂弧菌的檢測(cè)注:帶符號(hào)“●”、“▲”分別表示霍亂弧菌 rfbO1、CT基因Fig.4 Detection of toxigenic Vibrio cholerae serogroup O1 from environmental specimens by multiplex real-time quantitative PCR

目前熒光定量PCR技術(shù)以其靈敏度高,檢測(cè)速度快,特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),已在許多病原微生物的診斷中發(fā)揮了巨大作用。本研究組近年建立的單重?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)霍亂弧菌方法,也在疫情的應(yīng)急診斷中得到運(yùn)用,并取得較好效果[7]。在此基礎(chǔ)上分別在rfbO1基因序列檢測(cè)上采用 HEX標(biāo)記的熒光探針,在CT基因序列檢測(cè)上采用ROX標(biāo)記的熒光探針,組合成雙重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)體系,應(yīng)用美國(guó)Stratagene公司Mx3000P型熒光定量 PCR儀進(jìn)行雙通道熒光檢測(cè)與鑒定分型,實(shí)現(xiàn)一管雙檢,即可判斷出是否帶毒力基因,又可有效區(qū)分出是否為O1群霍亂弧菌,大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過(guò)程,節(jié)省了實(shí)驗(yàn)試劑?；魜y弧菌雙重?zé)晒舛縋CR快速診斷分型對(duì)控制疫情蔓延發(fā)展和制定及時(shí)防控策略具有重要意義。

本研究建立的方法不僅能夠最快在3 h內(nèi)準(zhǔn)確地鑒定出是否為帶毒力基因的O1群霍亂弧菌,而且與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和普通PCR法相比具有更高的靈敏度。我們以往研究的單重?zé)晒舛縋CR檢出限可達(dá)到1.0×102cfu/mL,本研究建立的雙重?zé)晒釶CR也可以達(dá)到單重?zé)晒夥ǖ淖畹蜋z出限。研究建立的雙重?zé)晒釶CR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.999和0.998,說(shuō)明此反應(yīng)體系穩(wěn)定性強(qiáng),具有較高的準(zhǔn)確度。

本研究建立的快速、靈敏、準(zhǔn)確的雙重?zé)晒舛縋CR分型檢測(cè)技術(shù),可應(yīng)用于外環(huán)境樣本中O1群霍亂弧菌的大范圍篩查,對(duì)霍亂疫情的預(yù)防及控制和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)具有重要價(jià)值。

[1]Lyon W J.TaqM an PCR for detection ofVibrio choleraeO1,O139,non-O1,and non-O139 in pure cultures,raw oysters,and synthetic seawater[J].Appl Environ Microbiol,2001,67(10):4685-4693.

[2]Begum K,Ahsan CR,Ansaruzzaman M,et a1.Toxin(s),other than cholera toxin,produced by envkonmental non O1 non 0139 Vibrio cholerae[J].Cell Mol Immunol,2006,3(2):115-121.

[3]黃曉蓉,呂海滄,鄭晶,等.多重 PCR方法檢測(cè)霍亂弧菌的研究[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(5):11-13.

[4]王云華,羅詩(shī)龍,伍朝暉,等.實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)水及水產(chǎn)品中霍亂弧菌[J].中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志,2006,29(5):311-313.

[5]黃世旺,盧亦愚,徐丹戈,等.TaqMan熒光定量PCR技術(shù)快速檢測(cè)霍亂弧菌方法的建立[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,l6(8):923-924,984.

[6《]霍亂防治手冊(cè)》編寫(xiě)組.霍亂防治手冊(cè)[M].5版.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部疾病控制司,1999:10.

[7]徐丹戈,黃世旺,盧亦愚,等.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法與常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)法及傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)霍亂弧菌的比較[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,8(增刊):54-56.