擬南芥AtMYB61基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

王 云, 任永兵, 楊 碩, 韓 宇, 陶 楊, 曹樹青

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院,安徽合肥 230009)

0 引 言

隨著一些抗逆基因的鑒定和抗逆機(jī)理不斷深入研究,將外源抗逆基因?qū)胫参锏幕蚬こ碳夹g(shù),在提高植物抗逆性方面具有更廣泛的應(yīng)用前景。但植物的抗逆應(yīng)答是一系列相關(guān)基因連續(xù)表達(dá)調(diào)控的極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控多個(gè)相關(guān)基因的表達(dá),所以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控是提高植物抗逆性更有效的方法[1]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥中最大的基因家族[2]。該基因家族主要在植物的生長發(fā)育方面發(fā)揮重要作用,如植物次級代謝、信號傳導(dǎo)、器官形成等方面[3]。另外,也有一部分參與了逆境脅迫介導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答[4-6]。大量研究證實(shí),一些MYB轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá)可以顯著增加植物對逆境的耐受性[7,8]。

MYB61轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域,其功能相當(dāng)廣泛,參與重金屬、低磷和干旱等脅迫的信號調(diào)節(jié),植物重金屬脅迫與氧化脅迫是相關(guān)的[9]。AtMYB61基因在植物中過量表達(dá),有利于進(jìn)一步研究AtMYB61基因的抗逆分子機(jī)理。因此,本文利用RT-PCR克隆AtMYB61基因,并構(gòu)建了 pCAMBIA2301-At-MYB61植物表達(dá)載體,為轉(zhuǎn)基因改良植物抗逆性和進(jìn)一步研究AtMYB61基因的抗逆分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料

哥倫比亞野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株,由美國擬南芥種質(zhì)資源庫提供,后由本實(shí)驗(yàn)室繁衍,貯存。

1.1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 Eco91Ⅰ(BstEⅡ)為 Fermentas公司產(chǎn)品;TransTaq Polymerase High Fidelity(HiFi)為北京全式金產(chǎn)品;DNA凝膠純化試劑盒、T4 DNA連接酶及氨芐青霉素(進(jìn)口分裝)為大連寶生物公司產(chǎn)品;First-Strand cDNA Synthesis Kit購自上海申能博彩生物科技公司;EZ-10 Spin Column Plasmid Mini-Preps Kit購自 BIO BASIC公司。其它試劑均為分析純。

1.1.3 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌 DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存,農(nóng)桿菌C58為中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)提供;pUCm-T載體和pCAMBIA2301載體均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 擬南芥幼苗的培養(yǎng)

用0.1%的HgCl2溶液浸泡種子3 min,去掉HgCl2溶液,再用無菌水沖洗5次。然后將擬南芥種子點(diǎn)種于MS固體培養(yǎng)基上,置于4℃冰箱中春化2 d后,轉(zhuǎn)置于光照強(qiáng)度為 100 μ mol/(m2·s)、22/18℃、16/8 h光周期條件下培養(yǎng)14 d。

1.2.2 常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)

電泳、DNA切膠回收、酶切、大腸桿菌和農(nóng)桿菌感受態(tài)制備、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取等操作方法參見文獻(xiàn)[10]。

1.2.3 擬南芥AtMYB61基因的克隆

采用Trizol法提取擬南芥幼苗總RNA。擬南芥cDNA合成以擬南芥幼苗總 RNA為模板,采用First-Strand cDNA Synthesis Kit使用說明合成cDNA。

擬南芥AtMYB61基因cDNA的PCR擴(kuò)增所用引物是根據(jù)GenBank中 AtMY B61基因mRNA序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),并在上游和下游引物的 5′端分別加入 BglⅡ、BstEⅡ酚切位點(diǎn)和2個(gè)保護(hù)堿基。上游引物:

5′-GA AGAT CTA TGGGGAGACAT TCT TGCTG TT-3′;下 游引 物 :5′-CGGGTCACCCTAAAGGGACTGACCA-3′。 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min,4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并回收純化。

擬南芥AtMYB61基因TA克隆與鑒定。將回收純化的AtMYB61基因DNA,用T4 DNA鏈接酶與pUCm-T載體連接,再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用含有100 μ g/mL 氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。

挑取單菌落在裝有1 mL的LB和1.5 mL的20 μ g/mL Amp離心管中37 ℃下培養(yǎng) 8～10 h。 取50 μ L 培養(yǎng)物,煮沸5 min,5 000 r/min,離心2 min后,取1～2 μ L上清進(jìn)行PCR檢測。菌落PCR驗(yàn)證后的菌液抽提質(zhì)粒,用雙酶切(BstEⅡ和BglⅡ)切下目的條帶,電泳檢測,并回收純化。將經(jīng)抽提質(zhì)粒雙酶切(BstEⅡ和BglⅡ)并做PCR鑒定后的陽性克隆菌落搖菌,菌液送至上海生物工程公司測序。

1.2.4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

(1)植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301和 At-MYB61基因的重組。提取 AtMYB61-pUCm-T載體,并用BstEⅡ和BglⅡ完全雙酶切切下目的基因片段,電泳檢測并回收純化。pCMBIA2301載體用BstEⅡ完全酶切,電泳檢測并回收目標(biāo)載體片段,此載體片段再用BglⅡ部分酶切,檢測并回收目標(biāo)載體片段。將該載體片段與目的基因片段用T4 DNA連接酶連接。

(2)重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌。用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,電轉(zhuǎn)化參數(shù)為:電壓2 500 kV/cm;電容 25 F;電阻500 Ψ。電擊3～5 ms后,取出電擊杯,迅速加入800 μ L的 LB液體培養(yǎng)基,混勻并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中,在 28 ℃震蕩培養(yǎng) 3 h;取 100 μ L菌液涂布于含 Gen(50 μ g/mL)和 Kan(50 μ g/mL)的LB平板中 28℃培養(yǎng) 24 h,即可長出陽性克隆。

(3)陽性pCAMBIA2301-AtMYB61克隆的菌落PCR與酶切鑒定。隨機(jī)挑取單菌落,在裝有1 mL的 LB和 1.5 mL的抗生素的離心管中28℃培養(yǎng) 12 h左右。取50 μ L培養(yǎng)物,煮沸5 min,5 000 r/min離心2 min,取 1～ 2 μ L 上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增后電泳檢測。選取菌落PCR驗(yàn)證后的菌液抽提質(zhì)粒,并用BstEⅡ和BglⅡ雙酶切后,電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtMYB61基因cDNA的PCR擴(kuò)增

提取擬南芥幼苗總RNA,用高保真反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增AtMYB61基因片段。實(shí)驗(yàn)中所獲得的目的片段與預(yù)期大小一致,CDS+酶切位點(diǎn)1 114 bp,兩端具有相應(yīng)的酶切位點(diǎn),如圖1所示。

圖1 AtMYB61基因cDNA克隆

2.2 AtMYB61基因TA克隆與鑒定

目的基因與pUCm-T載體連接并將連接產(chǎn)物純化,用熱擊法導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,用含100 μ g/mL氨芐青霉素的 LB平板篩選陽性單克隆。AtMYB61基因 TA克隆菌落PCR和酶切鑒定如圖2所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,所挑選的幾個(gè)單菌落均為含有重組質(zhì)粒的陽性克隆,其大小1 101 bp,所用引物沒有酶切位點(diǎn)。提取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切(BstEⅡ和BglⅡ)后,電泳檢測并回收。其酶切產(chǎn)物與擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)對比后發(fā)現(xiàn)大小基本一致,如圖2b所示,其大小為1 113 bp。選取已驗(yàn)證菌液送至上海生物工程公司測序。測序結(jié)果表明,擴(kuò)增結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列完全一致,表明高保真聚合酶的擴(kuò)增準(zhǔn)確無誤,基因克隆正確。經(jīng)完全雙酶切(Bst EⅡ和BglⅡ)獲得的目的基因片段,可用于植物表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因。

圖2 AtMYB61基因 TA克隆菌落PCR和酶切鑒定

2.3 重組T載體切下AtMYB61基因

選取AtMYB61-pUCm-T載體陽性克隆,搖菌培養(yǎng),抽提質(zhì)粒,用 BstEⅡ和BglⅡ完全雙酶切切下目的基因片段,如圖3所示。電泳檢測并回收純化,大小為1 113 bp。載體被切成了大小不等的幾段,是由于目的基因的插入方向有2種造成的。酶切所得片段是帶有酶切位點(diǎn)的黏性末端,可以和雙酶切獲得的表達(dá)載體片段直接連接。

圖3 重組T載體切下 AtMY B61基因

2.4 pCMBIA2301表達(dá)載體的酶切

2.4.1 pCMBIA2301載體的BstEⅡ完全酶切

用BstEⅡ?qū)CMBIA2301環(huán)狀載體酶切成線狀如圖4所示,產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化回收酶切產(chǎn)物。結(jié)果表明,pCMBIA2301載體被酶切成了單一的線狀,大小為11 633 bp。

2.4.2 pCMBIA2301載體的BglⅡ部分酶切

BstEⅡ酶將pCMBIA2301載體切成線狀切膠純化回收后,回收產(chǎn)物用BglⅡ進(jìn)行第2次酶切,由于pCMBIA2301載體上有2個(gè)BglⅡ酶切位點(diǎn),因此必須用部分酶切來獲得所需的載體片段。酶切時(shí)間和酶切體系須根據(jù)不同的酶和不同的酶切Buffer來調(diào)整,如圖5所示。圖 5中用10 000 bp做對照,a道表示酶切時(shí)間很短時(shí)還有一部分載體沒被切開(11 633 bp),b、c和d道為最適酶切時(shí)間的酶切,可以很大限度地獲得目的條帶(9 579 bp)。

圖4 pCMBIA2301載體BstEⅡ完全酶切

圖5 線狀pCMBIA2301的BglⅡ部分酶切

2.5 pCAMBIA2301-AtMYB61載體的構(gòu)建

從AtMYB61-pUMc-T載體上切下的At-MYB61目的基因片段和在植物表達(dá)載體上切下的表達(dá)載體片段具有互補(bǔ)的黏性末端,如圖6所示。

圖6 pCAMBIA2301-AtM YB61載體的構(gòu)建

按目的基因與載體的體積比約等于3∶1的比例用T4 DNA連接酶連接。純化連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)活化后涂布在含硫酸慶大霉素和卡那霉素的LB平板上,陽性菌落可在12～24 h后長出。

2.6 表達(dá)載體的菌落PCR與酶切鑒定

從轉(zhuǎn)化平板上選取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明陽性克隆中含有 AtMY B61基因片段,如圖7a所示。抽提已PCR驗(yàn)證菌液的質(zhì)粒,并用BstEⅡ和BglⅡ雙酶切鑒定,電泳檢測,結(jié)果也表明陽性克隆中含有 AtMYB61基因片段,如圖7b所示。從菌落PCR和酶切鑒定結(jié)果可知,載體構(gòu)建成功,可以用于后期擬南芥植株的遺傳轉(zhuǎn)化。AtMYB61基因片段構(gòu)建在CaMV 35S啟動(dòng)子后,可以在植物體中高效表達(dá)。

圖7 重組表達(dá)載體菌落PCR和酶切鑒定

3 結(jié)束語

MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物生長發(fā)育如細(xì)胞分化、器官的形成、植物形態(tài)建成的調(diào)控[11],以及次生代謝調(diào)控、激素合成和環(huán)境脅迫的應(yīng)答[12],因此,MYB被認(rèn)為是植物體內(nèi)數(shù)量最多、功能最多樣化的轉(zhuǎn)錄因子之一[13]。研究表明MYB61轉(zhuǎn)錄因子與重金屬、低磷和干旱等脅迫的調(diào)節(jié)有關(guān),但其 AtMYB61基因的抗逆分子機(jī)理有待進(jìn)一步闡明。

本研究利用RT-PCR技術(shù),以擬南芥中總RNA為模板成功克隆了AtMYB61基因。并且選用pCAMBIA2301載體,將 AtMY B61基因構(gòu)建到CAMV35S啟動(dòng)子下游,使 AtMYB61基因大量表達(dá),利用基因工程技術(shù)改良植物的抗逆性?？傊?植物表達(dá)載體 pCAMBIA2301-AtMYB61的構(gòu)建,不僅有利于改良植物抗逆性,而且有利于AtMYB61基因的抗逆分子機(jī)理的進(jìn)一步研究。

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